Molecular MedicineReports

Introduction

Pestycydy są substancjami lub mieszaninami substancji używanymi do zapobiegania, niszczenia, odstraszania lub łagodzenia szkodników, do których należą owady, gryzonie, chwasty, jak również inne niepożądane organizmy (1,2). W związku z tym, w ostatnich latach wzrosło światowe zużycie pestycydów, zwłaszcza w rolnictwie, na obszarach wiejskich. Ekstensywna produkcja rolna wiąże się z dużym zużyciem pestycydów, których pozostałości zanieczyszczają powietrze, glebę, wodę, rośliny, zebrane produkty, sprzęt, ubrania, a także tkanki ludzkie i zwierzęce. Stosowane pestycydy dostające się do organizmu człowieka poprzez oddychanie, połykanie i wchłanianie przez skórę mogą powodować zatrucia(2-4). Stopień powstałych uszkodzeń zależy od wewnętrznej toksyczności substancji oraz indywidualnego stanu zdrowia i wrażliwości (2,4-6).Ekspozycja na pestycydy stanowi potencjalne ryzyko zdrowotne dla ogółu populacji, a w szczególności dla pracowników rolnictwa(7-12).

Wiele badań koncentrowało się na związku pomiędzy ekspozycją na pestycydy a występowaniem nowotworów, takich jak mięsak, szpiczak mnogi, rak pęcherza moczowego, rak trzustki i białaczka(13-21). Niektórzy badacze zaobserwowali, że narażenie zawodowe na pestycydy wiąże się z ryzykiem wystąpienia chłoniaka nieziarniczego (NHL) (22-24).NHL jest heterogenną grupą nowotworów limfoproliferacyjnych, które mogą powstać z limfocytów B lub T. Wzajemne rearanżacje genów immunoglobulin komórek B lub receptorów komórek T występują zonkogenami w niedojrzałych komórkach limfoidalnych w szpiku kostnym lub w bardziej dojrzałych komórkach obwodowych narządów limfoidalnych (25,26).Te translokacje chromosomalne często prowadzą do nadekspresji onkogenów i powodują, że komórki stają się złośliwe i rozmnażają się w sposób niekontrolowany (26).

Translokacja chromosomalna t(14;18)(q32;q21) jest jedną z najczęstszych nieprawidłowości chromosomalnych w NHL, która występuje w 70-90% przypadków chłoniaka pęcherzykowego (FL), 20-30% chłoniaka rozlanego z dużych komórek B i 5-10% innych, mniej popularnych typów (27). Co więcej, zwiększona częstość występowania translokacji chromosomowej t(14;18)(q32;q21) została wykryta w limfocytach krwi obwodowej osób zawodowo narażonych na pestycydy (28,29).

Celem tego badania jest wykrycie wpływu pestycydów na translokację chromosomową t(14;18) u pracowników rolnych po krótkotrwałej ekspozycji.

Materiały i metody

Oświadczenie etyczne

Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyczny Szpitala Uniwersyteckiego w Katanii (Katania, Włochy), a pisemna świadoma zgoda wszystkich uczestników została uzyskana przed włączeniem ich do badania.

Projekt badania i narażenie na pestycydy

Badanie to było badaniem kontrolnym przeprowadzonym w prowincji Ragusa (Sycylia, Włochy), która liczy ~320,000 mieszkańców. Jest to okręg wysoce rolniczy z largeproportion of the population employed in ~25,000 farms producingfruits and vegetables in greenhouses and products derived from animal husbandry. Wszystkie te działania wiążą się ze stosowaniem dużych ilości pestycydów. Główne uprawy to marchew, ziemniaki i cukinia na otwartym polu oraz pomidory, bakłażany, papryka i cukinia w szklarniach (30).

Zrekrutowano 52 pracowników zawodowo narażonych na działanie pestycydów i 52 nienarażonych. Pracownicy narażeni na działanie pestycydów biorący udział w badaniu wykonywali swoją pracę w środkach ochrony indywidualnej (SPD): rękawicach, maskach, kombinezonach i okularach ochronnych. Aplikacja pestycydów odbywała się 5-6 razy w tygodniu i trwała 6-7 godzin roboczych. Pracownicy nieeksponowani (kontrola) nie mieli kontaktu z pestycydami. Pracownicy narażeni byli zatrudniani sezonowo (od kwietnia do sierpnia), przy uprawie pomidorów szklarniowych. Nie było możliwe wykrycie markerów biologicznych ekspozycji w odniesieniu do stosowanych pestycydów.

Tabela I. Pestycydy stosowane w szklarni w uprawie pomidorów.

W celu zebrania dokładnych danych demograficznych, historii medycznej, zwyczajów związanych z opieką zdrowotną oraz narażenia na pestycydy i/lub inne substancje chemiczne, przeszkoleni ankieterzy przeprowadzili ustrukturyzowany kwestionariusz badający ryzyko środowiskowe i zawodowe. Kryteriami wyłączenia były: cukrzyca, nadciśnienie, choroby tarczycy, wątroby, nerek, płuc i choroby hematologiczne.

t(14;18)-(IgH;Bcl-2)translokacja

Próbki krwi obwodowej (10 ml/przedmiot) pobrano w probówkach vacutainer EDTA (K2) (BD Biosciences, FranklinLakes, NJ, USA). DNA ekstrahowano z PBMCs zawartych w płaszczu buforowym zgodnie z instrukcjami producenta.

t(14;18)-(IgH;Bcl-2) translokacja, w regionie głównego punktu zwrotnego (MBR) i regionie mniejszego klastra (mcr), została oceniona za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), jak wcześniej opisano (31). AccuPrime™SuperMix (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) został użyty w celu zwiększenia specyficzności i czułości analizy PCR. Czułość naszego testu wynosiła 10-5.

Integralność DNA każdej próbki została zweryfikowana przez amplifikację 430 bp fragmentu genu hormonu wzrostu(GH) metodą PCR. Sekwencje primera forward i reverse użyte do amplifikacji GH były następujące: 5-CACCATTACATCCCACCT-3 i5-GCTTCTTGCTTGAGTGA-3, odpowiednio. Warunki PCR użyte do amplifikacji GH były identyczne z tymi, które podano dla MBR(31).

Produkty PCR zostały rozdzielone przez elektroforezę na 2,5% żelu agarozowym. Pojedyncze pasma uzyskane przez amplifikację MBR i MCR z próbek krwi były oczyszczane z żelu, a następnie sekwencjonowane na analizatorze genetycznymABI 310 (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami (31).

Analiza statystyczna

Dane zostały podsumowane jako średnie ± SD dla zmiennych ciągłych i częstotliwości dla zmiennych kategorycznych. Normalność sprawdzono testem Kołmogrowa-Smirnowa, a jednorodność wariancji testem Levenesa. Regresję logistyczną zastosowano do oceny występowania translokacji t(14;18) u pracowników narażonych na działanie pestycydów, palaczy i konsumentów alkoholu. Analizę danych przeprowadzono przy użyciu programu GraphPad Prism w wersji 7.0 (GraphPad Software,Inc., La Jolla, CA, USA).

Wyniki

Grupa eksponowana prezentowała charakterystykę podobną do grupy nieeksponowanej. W szczególności, wszyscy badani byli mężczyznami i nie było statystycznie istotnych różnic co do wieku, BMI, nawyków palenia, spożycia alkoholu, wieku produkcyjnego i ekspozycji na światło słoneczne.

Pracownicy rolni byli średnio narażeni na działanie pestycydów przez ~3,7 h dziennie przez 5 lat. Tabela II przedstawia główną charakterystykę próby; Ryc. 1.

Tabela II. Charakterystyka badanej populacji wyrażona jako częstość lub średnia ± SD.

Częstość występowania translokacji BCL2-IGH t(14;18) u pracowników zawodowo narażonych na pestycydy wynosiła 10% (5 z 52) vs.8% (4 z 52) u pracowników zawodowo narażonych na pestycydy.% (4 z 52) w grupie kontrolnej. Wyniki te wskazują na brak istotnego związku pomiędzy zawodowym narażeniem na pestycydy a zwiększoną częstością występowania translokacji chromosomowejBCL2-IGH t(14;18) u rolników (Tabela III).

Tabela III. Regresja logistyczna t(14;18)translokacja chromosomowa.

Nadto nie można było ocenić częstości występowania t(14;18) w zależności od rodzaju stosowanych pestycydów, ponieważ wszyscy badani byli narażeni na działanie insektycydów i fungicydów.

Dyskusja

Translokacja chromosomowa t(14;18)(q32;q21) jest jedną z najczęstszych nieprawidłowości chromosomalnych w NHL. Translokacja ta obejmuje 2 specyficzne loci, locus łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (IgH) na chromosomie 14q32 oraz locus B-cellleukemia/lymphoma 2 (BCL2) na chromosomie 18q2l (32).

Podczas typowego procesu translokacji gen BCL2 znajdujący się na chromosomie 18 jest zestawiany z aktywnym transkrypcyjnie genem IgH na chromosomie 14, co powoduje nadekspresję tego pierwszego. W konsekwencji, zwiększona anty-apoptotyczna funkcja BCL2 zwiększa przeżywalność komórek, co stanowi wczesny etap w procesie złośliwym NHL (32-34).

Zwiększona częstość występowania NHL została odnotowana wśród rolników i innych grup zawodowych pracujących z pestycydami(35). Ponadto, zwiększoną częstość występowania translokacji chromosomalnej t(14;18)(q32;q21) wykryto w limfocytach krwi obwodowej osób zawodowo narażonych na pestycydy (29,36,37).

W ostatnim badaniu przeprowadzonym na 96 pracownikach rolnych, Qaqish i wsp. (1) stwierdzili, że narażenie zawodowe na pestycydy w rolnictwie na otwartej przestrzeni oraz insektycydy stosowane na zwierzętach, zwiększyło częstość występowania translokacji chromosomalnej t(14;18). Rolnicy zawodowo narażeni na pestycydy i insektycydy byli 13,5 razy bardziej narażeni na nosicielstwo t(14;18). Z kolei 63,5% (61 z 96) rolników w porównaniu z 11,5% (11 z 96) osób z grupy kontrolnej było nosicielami translokacji.

W naszym badaniu częstość występowania translokacji BCL2-IGH t(14;18) u pracowników zawodowo narażonych na pestycydy wynosiła 10% (5 z 52) vs. 8% (4 z 52) u pracowników zawodowo narażonych na pestycydy. 8% (4 z 52) w grupie kontrolnej, bez istotnie statystycznej różnicy.

Różnica wyników pomiędzy naszymi badaniami a badaniami Qaqishet al (1) może być przypisana mniejszemu czasowi ekspozycji (50%) w porównaniu z tymi ostatnimi (10.9±7.9 vs. 5.1±0.8 lat).

Poza tym, w naszej próbie wszyscy pracownicy korzystali ze standardowych SPD, podczas gdy w badaniu Qaqish i wsp. (1) tylko 2,1% rolników używało masek, a 27,1% masek i rękawic.

Jak wykazali Qaqish i wsp. (1), używanie SPD może pomóc w zapobieganiu t(14;18).Ryzyko wystąpienia t(14;18) było istotnie związane z ekspozycją na różne rodzaje pestycydów: insektycydy, herbicydy i środki zapachowe (28).

Chiu i wsp. (28) zaobserwowali, że stosowanie insektycydów i herbicydów było związane z 2,6- do 3-krotnie wyższym ryzykiem t(14;18)-pozytywnego NHL. Wyniki te są zgodne z wynikami wcześniejszych badań, w których pestycydy były szczególnie związane z pęcherzykowym NHL (23,38-40), który jest zwykle pozytywny dla t(14;18).

Chiu et al (28) i Schroeder et al (41) stwierdzili, że ryzyko NHL związane z rolnictwem i narażeniem na dieldrynę, lindan, atrazynę lub fungicydy było związane z t(14;18).

We Włoszech stosowanie pestycydów takich jak dieldryna, lindan i atrazyna zostało zakazane dawno temu. Ponadto, narażone obiekty w naszym badaniu były narażone zarówno na fungicydy (propamocarbhydrochloride, metalaxyl-M, cyproconazole) jak i na insektycydy (thiamethoxam, deltamathrin, acrinathrin i abamectin) i tak działanie każdego z nich nie mogło być zróżnicowane.

Wyniki naszego badania są zgodne z wynikami zaobserwowanymi przez innych (1,28), którzy wykryli zwiększone ryzyko, gdy środki owadobójcze i chwastobójcze są stosowane przez dłuższy czas i w powiązaniu z użyciem SPD.

Oszacowaliśmy wpływ potencjalnych czynników zakłócających na częstość wykrywania translokacji BCL2-IGH t(14;18). Po pierwsze, spożycie alkoholu nie wpłynęło na częstość wykrywania, co może być związane z niską częstością spożycia alkoholu w badanej grupie (17,6±8,5 vs. 18,7±7,7 g/dzień odpowiednio u osób narażonych i nie narażonych). Dodatkowo nie stwierdzono związku pomiędzy wiekiem badanych a częstością wykrywania translokacji BCL2-IGH t(14;18) (1,29).

Nasze badania, jak również Roulland i wsp. (29) oraz Qaqish i wsp. (1) obejmowały osoby z medianą wieku<50 lat, przy czym związek z wiekiem wykryto jedynie w próbkach starszych niż 60 (42) i 70 lat (43). Ponadto, palenie papierosów nie zwiększyło częstości występowania translokacji BCL2-IGHt(14;18) w naszej próbie, co jest zgodne z wynikami wcześniejszych badań (28). Co więcej, ekspozycja na światło słoneczne nie miała wpływu na częstość wykrywania t(14:18), co jest zgodne z wynikami innych badań (29).

W związku z powyższym, na podstawie wyników naszego badania można wnioskować, że stałe stosowanie zalecanych przez prawo SPD oraz czas ekspozycji mogą mieć wpływ na częstość translokacji u pracowników narażonych na pestycydy.

Nasze badania powinny być kontynuowane z uwzględnieniem obserwacji tych pracowników, w celu lepszego określenia roli czynnika „czas ekspozycji” na translokację genów.

.