Oczyszczanie jednoniciowego DNA przez kopolimeryzację z akrylamidem i elektroforezę

Jednowłóknowy DNA (ssDNA) jest przydatny do aptamerów (1), samoorganizacji (2), origami DNA (3), obwodów DNA (4), sond hybrydyzacyjnych (5) i robotyki DNA (6). Chemicznie syntetyzowane DNA jest domyślnie jednoniciowe.

Przedstawiamy metodę wytwarzania ssDNA z produktu PCR. Użycie produktu PCR zamiast syntetycznego DNA może być korzystne, ponieważ PCR wprowadza mniej mutacji niż synteza chemiczna i może generować DNA dłuższe niż limit ∼120 baz dla syntezy chemicznej. Począwszy od próbki klonalnej, produkty PCR mogą mieć również znacznie wyższą czystość sekwencji niż chemicznie syntetyzowane DNA. Wysoka czystość sekwencji jest krytyczna dla wysokiej wydajności w technologii obwodów DNA (7).

Nasza metoda generowania pojedynczej nici (SSG) jest skalowalna i wymaga tylko jednego etapu oczyszczania. Usuwa ona niepożądaną nić komplementarną i przeprowadza oczyszczanie oparte na rozmiarze z resztek primera i niepożądanych produktów PCR. SSG poprzez kopolimeryzację i elektroforezę może być zastosowana do produktów zaawansowanych protokołów PCR, takich jak montaż Gibsona (8), w celu utworzenia długich, jednoniciowych produktów o dowolnej sekwencji. Może to być przydatne w origami DNA i innych zastosowaniach związanych z samoorganizacją.

SSG wykorzystuje dostępną w handlu modyfikację DNA znaną jako akrydyt. Modyfikacja ta dodaje polimeryzowalną grupę winylową, która włącza się do rosnącego łańcucha polimeru akrylamidu (9). DNA zmodyfikowane akrydytem było używane do wielu zastosowań, w tym jako przełączalny hydrożel (10), wychwytywanie rtęci (11) lub PDGF (12) oraz do modyfikowania szybkości elektroforezy określonych sekwencji (13). Nasza technika jest powierzchownie podobna do metody, za pomocą której grupa Churcha immobilizowała kolonie polimerazy w cienkich żelach poliakrylamidowych. Akrydyt jest krytyczny dla tworzenia klonalnych produktów PCR (polonies) w niektórych formach sekwencjonowania DNA (14).

W przypadkach, gdy wymagane są znaczne ilości czystego ssDNA, nasze podejście wykorzystujące zmodyfikowane akrydytem startery i immobilizację poliakrylamidową jest opłacalną opcją. Pokazujemy również, że ta technika może integrować SSG, rozdzielanie wielkości i elektroelucji w jednym kroku.

Materiały i metody

Jeśli nie podano inaczej, odczynniki zostały nabyte od Sigma Aldrich (St. Louis, MO) i używane bez dalszego oczyszczania. DNA pozyskano z IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) i użyto bez dalszego oczyszczania (informacje o sekwencji, patrz Tabela uzupełniająca S1).

Demonstracja wychwytywania nici akrydytowej

Do wstępnej demonstracji SSG przez współpolimeryzację z akrylamidem, a następnie elektroforezę, zmodyfikowaliśmy jeden primer z akrydytem i czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym Cy5. Drugi primer został zakupiony z zieloną modyfikacją fluorescencyjną 5′ fluoresceiny. Rysunek 1 przedstawia sposób przygotowania próbki DNA poprzez zmieszanie 100 μl 10% żelu denaturującego (prepolimer przed inicjacją polimeryzacji) ze 100 μl produktu PCR (∼20 pMol produktu) i odpowiednią masą suchego mocznika (5% końcowe stężenie akrylamidu, 7 M końcowe stężenie mocznika). DNA/prepolimer wprowadzano do suchej studzienki 5% denaturującego żelu PAGE. Żel ogrzewano w sposób opisany poniżej, a następnie przeprowadzano elektroforezę w celu oddzielenia pasma zielonej fluorescencji od unieruchomionego pasma czerwonej fluorescencji. Otrzymany żel obrazowano przy użyciu standardowego systemu obrazowania żelu z oświetleniem LED (FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA).

Generowanie i oczyszczanie pojedynczej nici (pionowa elektroforeza żelowa)

PCR przeprowadzono we wszystkich przypadkach przy użyciu zestawu reakcyjnego Accuprime Pfx (Life Technologies, Grand Island, NY) stosując 50 nM szablonu, 10 μM każdego primera i 8 cykli termicznych. Produkt PCR był denaturowany przez dodanie stałego mocznika do końcowego stężenia 7 M w 100 μl reakcji. Poliakrylamid przygotowano z komercyjnie uzyskanego roztworu podstawowego 40% akrylamidu w wodzie o stosunku akrylamidu do bis-akrylamidu 19:1 (Bio-Rad, Hercules, CA). Denaturujący poliakrylamid przygotowywano z końcowych stężeń 7 M mocznika, 20% akrylamidu i 0,25× buforu TBE. Polimeryzację inicjowano dodając 1 μl TEMED (N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiaminy) i 10 μl 10% nadsiarczanu amonu do porcji 1 mL denaturującego prepolimeru akrylamidu. Część tej mieszaniny (prepolimer przed inicjacją polimeryzacji) szybko mieszano w stosunku 1:1 ze 100 μl produktu PCR (pięć 20 μl reakcji PCR wg instrukcji producenta, połączonych) z 7 M mocznikiem (10% akrylamid, stężenie końcowe). Mieszaninę PCR/polimeryzujący akrylamid dodawano do suchej studzienki w standardowym pionowym denaturującym żelu PAGE. Pełną polimeryzację akrylamidu PCR/denaturującego zapewniło przepłukiwanie przestrzeni nad studzienką delikatnym strumieniem argonu lub 99,97% azotu (w celu wyparcia tlenu, który hamuje polimeryzację). Po ∼ 30 min polimeryzacji ustawialiśmy stanowisko do elektroforezy. Rozdrabnianie poliakrylamidu i ładowanie zmacerowanych kawałków do studzienki dało bardzo szerokie pasmo o nieregularnym kształcie, więc zrezygnowano z tego podejścia (dane nie pokazane). Polimeryzacja w obrębie studzienki była lepszym podejściem. Podgrzaliśmy bufor w mikrofalówce do wrzenia i dodaliśmy gorący (∼80°C-90°C) bufor do rezerwuaru katodowego (wylewając gorący bufor na wypełnione dołki), aby zachęcić do uwolnienia DNA z dołka. Dodawanie gorącego buforu kontynuowano do momentu napełnienia żelu do objętości niezbędnej do elektroforezy. Żel zawierający DNA był w bezpośrednim kontakcie z gorącym buforem, gdy przykładano napięcie. Gorący bufor powinien być zastosowany natychmiast i nie powinien być pozostawiony do ostygnięcia. Następnie przeprowadziliśmy elektroforezę zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1.

Bufory SB (5 mM boran sodu) i TBE mogą być używane jako bufory bieżące. SB i TBE zostały przygotowane w RT przy pH odpowiednio 8,42 i 8,36. W temperaturze 80°C, te wartości pH zmieniają się odpowiednio do 8.21 i 7.47. Ta zmiana pH jest przejściowa. Podczas elektroforezy żel ochładza się do temperatury 30°C-40°C. Ta zmiana pH nie spowodowała zauważalnej degradacji DNA.

W celu wizualizacji rozdzielenia dwóch nici, użyliśmy primerów zmodyfikowanych dwoma różnymi fluoroforami. Nić ruchoma była generowana przy użyciu primera modyfikowanego fluoresceiną. Starter (akrydyt) dla nici nieruchomej został przygotowany z wewnętrzną modyfikacją Cy5. Używając tych dwóch barwników mogliśmy wizualizować postęp rozdziału. Przeskanowaliśmy ten żel za pomocą wywoływarki żelu (FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA) po 45 min elektroforezy przy 500 V.

Jako alternatywne podejście, produkt PCR może być wstępnie skoncentrowany przez standardowe wytrącanie etanolem. Granulat może być następnie rozpuszczony w mniejszej objętości prepolimeru akrylamidu. W naszych rękach, zwiększone stężenie w studzience zostało zrównoważone przez straty podczas wytrącania. W niektórych przypadkach (np. w przypadku słabego pasma produktu) to podejście może być preferowane.

Pasmo fluorescencyjne zawierające jednoniciowy, zmodyfikowany fluoresceiną produkt zostało wycięte z żelu pod niebieskim oświetleniem LED przy ∼475 nm (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). DNA był eluowany standardową metodą „crush and soak” (15). Gdy eluowane (odzyskane) DNA było zbyt rozcieńczone, aby efektywnie wytrącało się z etanolu, zatężaliśmy je przez ekstrakcję butanolem. Produkt był następnie wytrącany etanolem i dalej analizowany jak wskazano poniżej.

Analiza PAGE

Znakowane fluoresceiną jednoniciowe produkty (ssDNA uwolnione przez denaturującą PAGE) były analizowane pod kątem czystości przy użyciu natywnej PAGE. W 10 μl ponownie zawiesiliśmy jednoniciowy produkt i oznaczyliśmy go ilościowo za pomocą spektroskopii UV-Vis. Wykonaliśmy równe stężenia molowe primera i jednoniciowego produktu i elektroforezowaliśmy te próbki i 25-bp zielony fluorescencyjny ladder (Jena Bioscience, Jena, Niemcy) na 15% natywnym żelu PAGE, który był wizualizowany za pomocą skanera Storm dla sygnału fluoresceiny.

Analiza Quencher

Aby dalej ustalić, że produkt był w rzeczywistości jednoniciowy, testowaliśmy hybrydyzację komplementarnego oligonukleotydu (sonda quench) zawierającego modyfikację 3′ quencher. Przy prawidłowej hybrydyzacji, sonda quench pozycjonuje pochłaniacz Iowa Black w odległości kilku nanometrów od modyfikacji 5′ fluoresceiny na nici komplementarnej. Powoduje to gwałtowny spadek intensywności fluorescencji. Sonda wygaszająca hybrydyzuje tylko do ssDNA. Jeżeli produkt jest dwuniciowy, wówczas hybrydyzacja zostanie zablokowana, a fluorescencja pozostanie niezmieniona. W probówkach do PCR przygotowano potrójne 10 μl próbki produktów modyfikowanych fluoresceiną o masie 100 nM (produkt PCR, produkt SSG i kontrola primera). Zmierzono je za pomocą fluorometru QuantiFluor (Promega, Madison, WI) dla początkowych wartości fluorescencji, a następnie dodano 1,1 równoważnika molowego DNA sondy wygaszającej, worteksowano, odwirowano i pozwolono na inkubację przez około 1 minutę. Fluorescencja była następnie rejestrowana w celu określenia, czy wystąpiło jakiekolwiek wygaszanie.

Porównanie technik generowania pojedynczej nici do produkcji aptamerów

W celu upewnienia się o skuteczności tej metody do generowania funkcjonalnych aptamerów, zakupiliśmy szablon do amplifikacji PCR znanej sekwencji aptamera wiążącej lizozym. Wzmocniliśmy ten szablon za pomocą primera modyfikowanego fluoresceiną i primera odwrotnego modyfikowanego akrydytem. Protokół SSG przeprowadziliśmy w sposób opisany powyżej. Lizozym sprzęgaliśmy z kulkami o średnicy 5,8 μm modyfikowanymi karboksylanami (Bangs Labs, Fishers, IN) za pomocą standardowego protokołu sprzęgania EDC. Kulki te inkubowano z produktem SSG, fluorescencyjnym randomizowanym DNA (bez podobieństwa sekwencji do aptamera) i chemicznie syntetyzowanym fluorescencyjnym aptamerem o tej samej sekwencji. Inkubowaliśmy również niepowlekane kulki z chemicznie syntetyzowanym fluorescencyjnym aptamerem jako kontrolę negatywną. Inkubacje prowadzono przez 30 min, a następnie kulki przemywano 3-krotnie. Cytometrię przepływową przeprowadzono na tych cząsteczkach przy użyciu aparatu FACScalibur (BD Bioscience San Jose, CA). Rejestrowano rozkład intensywności fluorescencji przy wzbudzeniu światłem 488-nm.

Generowanie i oczyszczanie pojedynczej nici (elektroforeza w żelu poziomym)

Żel poliakrylamidowy denaturujący 7 M mocznika był rzutowany poziomo, jak opisano wcześniej (16). W skrócie, 25 mL roztworu prepolimeru (7M mocznik, 6% akrylamid/bis-akrylamid, bufor SB) zainicjowano 84 μl APS i 20 μl TEMED. Żelowy prepolimer wylewano do poziomej formy. Następnie formę umieszczano w plastikowym worku, który przedmuchiwano azotem. Żel pozostawiono do polimeryzacji na 30 min. DNA znakowane fluoresceiną i akrydytem mieszano w 1 M fosforanie sodu o pH 8,0 i annektowano przez podniesienie temperatury do 80°C i powolne chłodzenie w tempie 0,1°C na sekundę do RT. Mieszaninę chłodzono powoli, aby promować hybrydyzację międzycząsteczkową pomiędzy dwiema nićmi. Mieszaninę prepolimerową (2,5 mL) inicjowano dodając 8,4 μl APS i 2 μl TEMED. Po wymieszaniu, 20 μl tego roztworu dodawano do 5 μl roztworu DNA. Następnie przenoszono go do suchej studzienki w żelu poliakrylamidowym. W celu uniknięcia zniekształceń linii pola elektrycznego, pozostałe studzienki wypełniono akrylamidem nie zawierającym DNA. Obciążony żel został umieszczony w plastikowej torebce i oczyszczony azotem. Żel prowadzono przy napięciu 10 V/cm przez 10 min. Następnie obrazowano go przy użyciu transiluminatora z niebieską diodą LED i aparatu cyfrowego. W celu uwolnienia ssDNA z usieciowanego żelu w studzience, 25 mL buforu SB podgrzano do wrzenia w mikrofalówce. Następnie gorący bufor wylano na żel. Elektroforezę kontynuowano przy napięciu 10 V/cm przez 10 min. Żel był ponownie obrazowany jak opisano powyżej dla porównania.

Wstępne kojarzenie pomiędzy DNA znakowanym fluoresceiną i akrydytem było promowane przy użyciu 1 M buforu fosforanu sodu. Gdyby DNA było trzymane razem tylko przez hybrydyzację, 7 M mocznik i wymiana buforu na 5 mM bufor SB podczas elektroforezy byłyby odpowiednie do uwolnienia DNA do żelu. Zamiast tego konieczne było zastosowanie ciepła. Wykazało to, że ruchoma nić DNA jest związana lub zaplątana raczej z żelem niż ze swoją komplementarną nicią DNA.

Wyniki i dyskusja

Modyfikowane akrydytem DNA jest nieruchome pod wpływem elektroforezy

Z dwóch nici produktu dsDNA PCR, nić akrydytowa jest uwięziona w kopolimerze, podczas gdy nić komplementarna jest ruchoma. Aby to zademonstrować, przeprowadzono PCR z jednym primerem zmodyfikowanym zarówno akrydytem, jak i czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym (Cy5). Starter odwrotny był modyfikowany fluoresceiną. Produkt PCR był polimeryzowany w denaturującym żelu PAGE (5%). Schemat procesu przedstawiono na rysunku 1. Początkowo obie nitki, fluorescencyjna zielona i fluorescencyjna czerwona, ulegają kolokalizacji (żel zabarwiony na żółto). Po przyłożeniu napięcia, tylko produkt znakowany fluoresceiną (zielony) migruje do żelu. Pasmo akrydytowe i znakowane Cy5 (czerwone) jest utrwalone w końcowym obrazie żelu (Rysunek 1B). Dodatkowo, resztki primera z reakcji PCR są wyraźnie widoczne jako drugie zielone pasmo. Po elektroforezie, czysty, jednoniciowy produkt może być cięty i eluowany zgodnie ze standardowymi protokołami oczyszczania żelu.

Weryfikacja jednoniciowego DNA

Wyizolowaliśmy jednoniciowe, zmodyfikowane fluoresceiną DNA przez cięcie i elucję pasma zainteresowania. Aby wykazać, że produkt odzyskany tą metodą jest jednoniciowy, zastosowaliśmy dwie różne metody. Pierwszą z nich była analiza natywnego żelu. Rysunek 2A przedstawia obraz natywnego żelu zawierającego primer, produkt PCR (dsDNA) i ssDNA oczyszczony tą metodą. W natywnym żelu widać wyraźny rozdział pomiędzy dsDNA i ssDNA. Po SSG z primerem akrydytowym (a następnie przecięciu żelu i elucji produktu) większość wyizolowanego DNA jest jednoniciowa.

Potwierdziliśmy ten wynik przy użyciu zmodyfikowanej przez quencher sondy hybrydyzacyjnej (Figura 2B). Sonda ta została zaprojektowana w taki sposób, aby doprowadzić do zbliżenia pochłaniacza do cząsteczki fluoresceiny na produkcie ssDNA. Po hybrydyzacji, cząsteczka pochłaniacza zmniejsza intensywność fluorescencji o ∼90%. Ponieważ sonda hybrydyzuje tylko do ssDNA, eksperyment ten dowodzi, że produkt zmodyfikowany fluoresceiną był jednoniciowy. Jako kontrolę negatywną przetestowaliśmy również produkt PCR dsDNA. Dwuniciowy produkt PCR nie był zdolny do hybrydyzacji z sondą tłumiącą; dlatego jego fluorescencja pozostała praktycznie niezmieniona.

Aptamery syntetyzowane przez PCR oczyszczone przez współpolimeryzację i elektroforezę

Wysoko czyste ssDNA jest produkowane przez naszą technikę SSG. Oczyszczaliśmy produkty aptamerów ssDNA z PCR za pomocą dwóch metod: (i) SSG przez ko-polimeryzację i elektroforezę oraz (ii) technikę immobilizacji biotyny-awidyny opisaną gdzie indziej (tj. Polysciences Technical data sheet 753) (17,18). Jednoniciowe aptamery zostały również wytworzone w drodze syntezy chemicznej. Rysunek 3A przedstawia aptamery ssDNA wytworzone przy użyciu trzech różnych metod. Pas 1 to drabinka znacznikowa do porównania wielkości. Pasek 2 pokazuje oczyszczony ssDNA wygenerowany przez PCR ze starterem akrydytowym, po którym następuje ko-polimeryzacja z akrylamidem, elektroforeza i oczyszczanie w żelu. Widoczne jest tylko jedno pasmo o rozmiarze właściwym dla ssDNA. Pasek 3 to ssDNA generowane przez PCR z biotynylowanym primerem, po którym następuje oczyszczanie za pomocą kulek magnetycznych pokrytych awidyną. Pas 4 to chemicznie syntetyzowane DNA o tej samej sekwencji. Oczyszczony aptamer ssDNA z SSG metodą ko-polimeryzacji i elektroforezy wykazał wysoką czystość ssDNA.

Następnie staraliśmy się sprawdzić, czy ta procedura wytwarza funkcjonalne aptamery. W tym celu wygenerowaliśmy wcześniej opisany aptamer przeciwko lizozymowi, stosując PCR ze zmodyfikowanymi starterami. Aptamer „Clone 1” przeciwko lizozymowi został po raz pierwszy wyprodukowany w laboratorium Ellingtona i został pierwotnie wybrany jako aptamer RNA (19); inne grupy doniosły, że sekwencja DNA również działa jako aptamer (20,21). Stwierdziliśmy, że zarówno PCR, jak i chemiczna synteza DNA wytworzyły funkcjonalny aptamer. Na podstawie tych i innych eksperymentów wnioskujemy, że jest to jeden z niewielu wyjątkowych przypadków, w których zarówno RNA, jak i jego macierzysta sekwencja DNA wiążą cel. Jest to dziwny i przypadkowy wynik; większość aptamerów nie funkcjonuje, gdy są tłumaczone bezpośrednio na inny składnik chemiczny. Wyniki te potwierdzają wiele przypadków w literaturze wskazujących, że aptamer Klonu 1 przeciwko lizozymowi jest szczególnym przypadkiem.

Analiza cytometrii przepływowej również wykazała, że oczyszczony przez SSG aptamer ssDNA jest funkcjonalny. Rysunek 4B przedstawia kulki pokryte lizozymem wystawione na działanie przypadkowego DNA, chemicznie syntetyzowanego aptameru przeciwko lizozymowi lub naszego oczyszczonego przez SSG aptameru przeciwko lizozymowi. Zarówno aptamery oczyszczone przez SSG jak i chemicznie syntetyzowane wykazały silne wiązanie z kulkami pokrytymi lizozymem, podczas gdy losowe DNA nie wykazało znaczącego wiązania z kulkami lizozymu. Wskazuje to, że te interakcje są specyficzne dla sekwencji aptamera. Niepowlekane kulki nie wykazują fluorescencji z lub bez aptamera, wskazując, że wiązanie jest specyficzne dla białka.

Ogrzewanie uwalnia DNA z dołków

Podczas oczyszczania aptamerów ssDNA z produktu PCR metodą SSG, konieczne było ogrzewanie żelu w celu ułatwienia elektroforezy DNA (patrz „Materiały i metody”). Aby zrozumieć, dlaczego było to konieczne, zastosowaliśmy horyzontalny PAGE. Bez zastosowania ciepła, pożądany produkt ssDNA PCR został zatrzymany w studzience, pomimo użycia 7 M mocznika i gradientu napięcia.

Nasza pierwsza hipoteza była taka, że to zatrzymanie było spowodowane 80 bp hybrydyzacji w produkcie PCR. Aby sprawdzić tę teorię, zmniejszyliśmy komplementarność do 23 bp przez annealię znakowanego fluoresceiną DNA aptamera Klonu 1 (oznaczonego F-Aptamer na rycinie 4) do 23-nukleotydowego primera zmodyfikowanego akrydytem (oznaczonego AC-Clone1-P2 na rycinie 4) i przeprowadziliśmy SSG przez współpolimeryzację i elektroforezę. Pomimo stosunkowo krótkiej hybrydyzacji 23 bp, znaczne ilości DNA aptameru zostały zatrzymane w studzience (Rysunek 4A, dolny pas). Wskazuje to, że nasza hipoteza była błędna, ponieważ krótszy odcinek hybrydyzacji 23 bp, który powinien być łatwo denaturowany w 7 M moczniku, nie pozwolił na uwolnienie pożądanej nici ssDNA z dołka.

Następnie przetestowaliśmy hipotezę, że retencja była zależna od długości. Tutaj, annektowaliśmy zmodyfikowany 5′-akrydytem 19-nukleotydowy oligonukleotyd (oznaczony AC-DNA na Rysunku 4) do 19-nukleotydowego w pełni komplementarnego, znakowanego fluoresceiną oligonukleotydu (oznaczonego F-DNA* na Rysunku 4). Pomimo podobnej długości hybrydyzacji, krótkie DNA zostało łatwo oczyszczone z dopełniacza w żelu denaturującym bez zastosowania ciepła. Praktycznie cała 19-nukleotydowa, znakowana fluoresceiną ruchoma nić dostała się do żelu (Rysunek 4A, środkowy pas). W celu wykazania, że zmodyfikowany akrydytem 19-mer został zatrzymany, nić zmodyfikowana zarówno fluoresceiną jak i akrydytem (oznaczona AC-DNA-F na rysunku 4) została również współpolimeryzowana w studzience (górny pas) i została z powodzeniem zatrzymana. (patrz „Materiały i metody” i Tabela uzupełniająca S1 dla szczegółów sekwencji i nomenklatury)

Po pierwszych 20 minutach elektroforezy (bez ogrzewania), było jasne, że duża część DNA aptameru Klonu 1 nie była ruchoma (pomimo krótkiej długości hybrydyzacji). W celu uwolnienia aptamerowego DNA z poliakrylamidu, konieczne było podgrzanie żelu. W tym celu podgrzaliśmy bufor w mikrofalówce do temperatury bliskiej wrzenia, a następnie wylaliśmy go na żel w rejonie dołków. Elektroforeza była kontynuowana przez dodatkowe 20 minut (Rysunek 4B, dolny pas), a pasmo aptameru stało się ruchome. To nowe pasmo miało taką samą ruchliwość jak początkowe ruchome pasmo, co wskazuje, że był to ten sam gatunek aptameru. Podobnie, była to ta sama próbka DNA, która dała tylko jedno pasmo na rysunku 3A. Ten eksperyment wykazuje konieczność ogrzewania żelu w celu uwolnienia całego długiego ssDNA z poliakrylamidu. Zatrzymanie DNA w studzience nie jest spowodowane hybrydyzacją, ale prawdopodobnie splątaniem w matrycy poliakrylamidowej.

Horizontal PAGE for single-strand generation and integrated electroelution

Użycie poziomego żelu pozwala na przeprowadzenie elektroelucji zamiast cięcia i ekstrakcji pasma produktu. Użycie drugiego grzebienia ekstrakcyjnego do dodatkowych studzienek do elektroelucji i ekstrakcji w poziomym PAGE przyspieszyło SSG i elektroelucję DNA. Użyliśmy oprogramowania Inkscape do zaprojektowania oddzielnego grzebienia do elektroelucji, który był głębszy i szerszy niż grzebień do ładowania (patrz Materiał uzupełniający dla szablonu użytego do wycięcia grzebieni). Projekt został wycięty laserowo w akrylu za pomocą wycinarki laserowej CO2 (patrz Rysunek 5, A i B).

Typowo, PAGE jest przeprowadzany przy użyciu pionowego żelu między szklanymi płytkami. Aby odlać poziomy żel PAGE, konieczne było wykluczenie tlenu podczas polimeryzacji. Polimeryzację przeprowadziliśmy w worku wypełnionym azotem (lub argonem) w celu wykluczenia tlenu. Żel odlewano za pomocą dwóch grzebieni, a elektroforezę prowadzono według standardowych procedur elektroforezy w żelu poziomym.

Rycena 5C przedstawia żel poziomy dla SSG metodą kopolimeryzacji i elektroforezy z elektroelucji. Pasy 1-4 (od góry) zawierają pulę aptamerów. Pasek 5 pozostawiono pusty, aby uniknąć niezamierzonego zanieczyszczenia krzyżowego; standard primera w pasku 6 był obecny w celu odróżnienia niepożądanego pasma. Pula została amplifikowana przy użyciu primera modyfikowanego akrydytem i primera znakowanego fluoresceiną. Pasmo zmodyfikowane akrydytem zostało zatrzymane w studzience. Produkt znakowany fluoresceiną jest wyraźnie widoczny w niebieskim oświetleniu LED. Pozwoliliśmy, aby primer przepłynął przez studzienki ekstrakcyjne i wyszedł na drugą stronę żelu (patrz Rysunek 5D). Następnie można było obserwować pasma produktu zbliżające się do studzienek ekstrakcyjnych pod transiluminatorem światła niebieskiego w czasie rzeczywistym. Gdy pasma produktu znalazły się w studzienkach, zostały odessane za pomocą pipety. Proces trwał około 1 godziny. Wytrącanie i odzyskiwanie przebiegało zgodnie z opublikowanymi protokołami selekcji aptamerów. Wyeliminowało to potrzebę oddzielnego etapu rozdzielania nici lub całonocnej ekstrakcji żelu.

Istnieje kilka metod izolacji ssDNA z dsDNA. Metody oczyszczania ssDNA z produktów PCR obejmują: indukowaną zmianę ruchliwości (22), unieruchomienie paciorków biotyny-awidyny (18), selektywne trawienie DNazą (23) oraz asymetryczne dodawanie primerów PCR (24). Metody te różnią się pod względem kosztów, czystości i skalowalności. Wywołana zmiana ruchliwości (22) w jednym primerze może spowodować problemy w amplifikacji (np. primery modyfikowane PEG mogą działać gorzej w PCR), a enzymatyczne trawienie DNazą (23) lub chemiczne przerwanie jednej nici pozostawi zanieczyszczenia (jak również wprowadzi kolejny etap do całego procesu). Asymetryczne dodawanie primerów PCR (24) pozostawi znaczną ilość dsDNA w produkcie i jest wysoce podatne na błędy amplifikacji. Najpopularniejszą metodą jest ekstrakcja niepożądanej, biotynylowanej nici przy użyciu mikrosfer pokrytych awidyną (18). Metoda ta ma kilka pułapek. Nieprzereagowany primer zajmuje miejsca awidyny na kulkach, a interakcja biotyna-awidyna ulegnie rozpadowi w temperaturze topnienia długiego, dwuniciowego DNA (25). Przyczynia się to do znacznych zanieczyszczeń dsDNA. Metody oparte na kulkach wiążą się ze znacznymi kosztami: 1,80 USD/nMol za kulki awidyny plus 0,50 USD/nMol za primer biotyny. SSG metodą ko-polimeryzacji i elektroforezy wymaga jedynie primera akrydynowego, który kosztuje 0,80$/nMol. Poliakrylamid jest bardzo tani i skalowalny. Mobilność elektroforetyczna jest drugim wymiarem oczyszczania, nieodłącznym dla tej techniki. Zarówno nitka zmodyfikowana akrydytem, jak i resztki primera są usuwane z reakcji PCR w jednym kroku.

Wykazaliśmy, że SSG może być użyta do oczyszczania funkcjonalnego aptamera. Technika ta może być również wykorzystana do oczyszczania puli ssDNA w trakcie selekcji aptamerów DNA. Ponadto, SSG może znaleźć zastosowanie w generowaniu ssDNA dla sond powinowactwa lub szkieletów dla origami DNA (3). Należy zauważyć, że w porównaniu z syntezą chemiczną, wytwarzanie DNA metodą PCR ma znacznie wyższą wierność sekwencji, co jest kluczowe dla zastosowań takich jak obliczenia DNA/obwody DNA (26).

.