Poprawa rozpuszczalności białka rekombinowanego przy użyciu znacznika MBP

Zasoby „Centra Zasobów Technicznych „Zasoby Techniczne Białek „Uwagi Techniczne „Znacznik MBP Uwagi „Znacznik MBP

Ekspresja E. coli

Generowanie białka rekombinowanego wymaga użycia gospodarza ekspresji i E. coli jest zwykle najlepszym wyborem do tego celu. Połączenie prostej genetyki, łatwości hodowli, szybkiej ekspresji i wysokiej wydajności sprawia, że jest to atrakcyjny gospodarz, podczas gdy brak wydajnego mechanizmu posttranslacyjnego, stronniczość w stosowaniu kodonów i trudność w produkcji białek o wyższej masie cząsteczkowej czyni go niekorzystnym. Jednakże jednym z największych nieszczęść w ekspresji E.coli jest ekspresja nierozpuszczalna – zjawisko, w którym rekombinowana nadekspresja skutkuje tworzeniem się nierozpuszczalnych agregatów białkowych zwanych ciałkami wtrętowymi.

Sposoby radzenia sobie z ciałami wtrętowymi i poprawiania rozpuszczalności białek docelowych

Gdy tworzą się ciała wtrętowe, naukowcy zwykle próbują kłopotliwego procesu zwanego solubilizacją i ponownym składaniem białka in vitro, aby odzyskać rozpuszczalne białko lub próbują optymalizacji ekspresji na poziomie procesu lub poziomie molekularnym, aby zapobiec problemom związanym z nierozpuszczalnością .

Przykłady optymalizacji poziomu procesu obejmują metody, które nie wymagają inżynierii celu. Na przykład optymalizacja warunków ekspresji, dostosowanie warunków wzrostu i indukcji, zmiana mediów, buforów itp. Alternatywą byłoby wypróbowanie podejścia molekularnego i manipulowanie białkiem docelowym poprzez eliminację niepożądanych elementów w obrębie jego sekwencji, tworzenie skrótów lub mutowanie niektórych aminokwasów w celu uczynienia białka bardziej rozpuszczalnym. Można również przyjąć racjonalne podejście do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce w oparciu o informacje o strukturze lub zastosować podejście ukierunkowanej ewolucji i zbadać rozpuszczalność losowych mutantów punktowych, delecji i fragmentów. Lepszym, łatwiejszym podejściem byłoby przyjęcie strategii partnera fuzyjnego i wykorzystanie partnera fuzyjnego, który uczyniłby białko docelowe bardziej rozpuszczalnym.

Podejście partnera fuzyjnego w celu poprawy rozpuszczalności białka

Używając tego podejścia, trudne do ekspresji białko lub peptyd jest fuzjowane z innym, stabilnym, wysoce rozpuszczalnym białkiem w celu ustabilizowania ekspresji, z założeniem, że białko fuzyjne będzie napędzać powstałą ekspresję. Chociaż wiele białek jest wysoce rozpuszczalnych, nie wszystkie są skuteczne jako wzmacniacze rozpuszczalności białek. Pod tym względem białko wiążące maltozę może być bardzo użytecznym partnerem zwiększającym rozpuszczalność białek. W badaniu porównawczym mającym na celu zbadanie ich właściwości zwiększających rozpuszczalność białek, znacznik MBP E. coli okazał się być znacznie skuteczniejszym partnerem rozpuszczalności białek niż białka Glutathione-S-transferase (GST) i Thioredoxin (TRx).

Rysunek 1: Zalecenie naukowca GenScript dotyczące projektowania konstrukcji

O znaczniku MBP i jego mechanizmie działania

MBP jest naturalnie występującym u E. coli białkiem o masie około 42 kDa, kodowanym przez gen malE, które jest odpowiedzialne za wychwyt, rozkład i transport maltodekstryny, węglowodanu. Pierwotnie opracowana w latach 80. jako znacznik ekspresji białek, jest znana ze znacznego zwiększania rozpuszczalności różnych białek docelowych. Chociaż dokładny mechanizm zwiększania rozpuszczalności białka przez znacznik MBP jest niejasny, wiadomo, że stabilizuje on i chroni białko pasażera przed degradacją proteolityczną podczas i po syntezie białka. Wydajno¶ć cytoplazmatyczna białek fuzjowanych z MBP jest zwykle wyższa, ponieważ białko fuzyjne zapewnia niezawodny kontekst dla wydajnej inicjacji translacji. Proponuje się również, że znacznik MBP może działać jako chaperon poprzez interakcje poprzez wystawione na działanie rozpuszczalnika gorące miejsce na jego powierzchni, które stabilizuje w przeciwnym razie nierozpuszczalne białko pasażera.

Użycie znacznika MBP

Choć wykazano, że znacznik MBP połączony z N- lub C-końcem zwiększa rozpuszczalną ekspresję rekombinantów, powszechnym podejściem jest połączenie go z N-końcem. Niestety, ponieważ żaden znacznik nie może być idealny do wszystkich zastosowań, w celu zwiększenia uniwersalności znaczników i dalszych zastosowań, opracowano kombinatoryczne metody znakowania dla różnych potrzeb. Dwa znaczniki powinowactwa wyrażone w tandemie wraz z miejscem rozszczepienia proteazy poprzedzającym białko docelowe umożliwiają zastosowanie wielu strategii oczyszczania. Włączając znacznik zwiększający rozpuszczalność w połączeniu ze znacznikiem oczyszczającym, uzyskuje się poprawę rozpuszczalności białka i wydajności ekspresji, jak również metody wydajnego oczyszczania

Figura 2: Ogólny schemat strategii projektowania konstrukcji – połączenie znacznika powinowactwa/rozpuszczalności na N-końcu, miejsce rozszczepienia proteazy, a następnie białko docelowe może dać dobre wyniki, szczególnie w przypadku nierozpuszczalnych białek docelowych. Sekwencja łącznika może często pomóc w problemach z rozszczepianiem proteolitycznym.

Purfikacja białek znakowanych MBP

Inną zaletą stosowania strategii fuzji MBP, poza zwiększeniem rozpuszczalności białka, jest ułatwienie oczyszczania białka docelowego. MBP jest naturalnym znacznikiem powinowactwa, który wiąże się z żywicą amylozową i może być wykorzystany do jednoetapowego oczyszczania powinowactwa poprzez wiązanie się z usieciowaną amylozą. Białka rekombinowane ze znacznikiem MBP związane z unieruchomioną amylozą są zwykle eluowane w warunkach niedenaturujących przy użyciu maltozy.

Wady tej strategii

• Rozszczepienie białka docelowego może być problemem z powodu przeszkody sterycznej ze strony znacznika MBP
• Żywica amylozowa może być krucha i stosunkowo droga
• Wytrącanie białka docelowego po rozszczepieniu
• Niektóre białka fuzyjne MBP nie wiążą się wydajnie z żywicą amylozową, a nawet gdy się wiążą, Wydajność może być problemem

Wniosek

Choć nie istnieje proste, globalne rozwiązanie problemów z nierozpuszczalnością w ekspresji E.coli, dobrze zaprojektowany konstrukt i starannie opracowana strategia ekspresji może dać pożądane białko rozpuszczalne. MBP jest niezawodnym znacznikiem rozpuszczalności w produkcji rekombinowanych białek rozpuszczalnych i chociaż rozpuszczalność jest jednym z najważniejszych elementów kampanii produkcji białek, celem końcowym nie zawsze powinna być rozpuszczalność. Poziomy ekspresji, aktywność białka, czystość, jednorodność i stabilność są wszystkimi ważnymi czynnikami, które również muszą być brane pod uwagę przed rozpoczęciem kampanii produkcji rekombinowanego białka.

Kilka publikacji demonstrujących użyteczność znacznika MBP

Production of Fusokines using MBP -Maltose- Binding Protein Fusion Allow Allows of Fusokines using MBPBinding Protein Fusion Allows for High Level Bacterial Expression and Purification of Bioactive Mammalian Cytokine Derivatives (wrzesień 2014)

The rescue of aggregation-prone proteins using MBP -Rescuing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (May 2014)

MBP for soluble protein production in E. coli -Hexahistidine-tagged maltose-binding protein as a fusion partner for the production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A., i Leiting, B. (1997). High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His6-tag and maltose binding protein double-affinity fusion system. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. and Waugh, D. S. (2002). Differential effects of supplementary affinity tags on the solubility of MBP fusion proteins. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., and Waugh, D. S. (2005) Gateway vectors for the production of combinatorially tagged His6-MBP fusion proteins in the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategies to maximize heterologous protein expression in Escherichia coli with minimal cost. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Expression and purification of the first nucleotide-binding domain and linker region of human multidrug resistance gene product: comparison of fusions to glutathione S-transferase, thioredoxin and maltose-binding protein. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci 2001, 10:622-630

Planujesz projekt związany z ekspresją bakteryjną? Uzyskaj bezpłatną wycenę w ciągu kilku sekund dla naszych pakietów BacPower™ Gwarantowana Ekspresja Białek.

Oferty i Zamawianie

#Automatyczna wycena zostanie wygenerowana tylko wtedy, gdy sekwencje kwalifikują się do Gwarantowanej usługi, jak określono w naszej zastrzeżonej platformie analizy sekwencji, w przeciwnym razie nasz Doradca Techniczny skontaktuje się z Państwem z niestandardową wyceną produkcji białek. Prosimy mieć pewność, że nasze niestandardowe usługi są równie wysokiej jakości i konkurencyjne, jak nasze usługi Gwarantowane.

Nasi przedstawiciele obsługi klienta są dostępni 24 godziny na dobę, od poniedziałku do piątku, aby Państwu pomóc.