Kluczowe enzymy i składnikiEdit
W procesie rekombinacji V(D)J pośredniczy rekombinaza VDJ, która jest zróżnicowanym zbiorem enzymów. Kluczowymi enzymami zaangażowanymi w ten proces są geny aktywujące rekombinację 1 i 2 (RAG), terminalna deoksynukleotydylotransferaza (TdT) oraz nukleaza Artemis, członek wszechobecnej ścieżki NHEJ (non-homologous end joining) służącej do naprawy DNA. Wiadomo, że w procesie tym bierze udział kilka innych enzymów, w tym kinaza białkowa zależna od DNA (DNA-PK), białko 4 X-ray repair cross-complementing protein 4 (XRCC4), ligaza DNA IV, czynnik 1 non-homologous end-joining factor 1 (NHEJ1; znany również jako Cernunnos lub XRCC4-like factor ), niedawno odkryty paralog XRCC4 i XLF (PAXX) oraz polimerazy DNA λ i μ. Niektóre zaangażowane enzymy są specyficzne dla limfocytów (np. RAG, TdT), podczas gdy inne występują w innych typach komórek, a nawet wszechobecnie (np. komponenty NHEJ).
Aby utrzymać specyficzność rekombinacji, rekombinaza V(D)J rozpoznaje i wiąże się z sekwencjami sygnału rekombinacji (RSSs) flankującymi segmenty genów zmiennych (V), różnorodności (D) i łączenia (J). RSS składają się z trzech elementów: heptameru zawierającego siedem konserwowanych nukleotydów, regionu dystansowego o długości 12 lub 23 bazepary oraz nonameru zawierającego dziewięć konserwowanych nukleotydów. Podczas gdy większość RSS różni się sekwencją, konsensusowe sekwencje heptameru i nonameru to odpowiednio CACAGTG i ACAAAAACC; i chociaż sekwencja regionu odstępu jest słabo konserwowana, to jego długość jest wysoce konserwowana. Długość regionu dystansowego odpowiada w przybliżeniu jednemu (12 bazepairs) lub dwóm skrętom (23 bazepairs) helisy DNA. Zgodnie z tzw. reguł± 12/23 segmenty genów, które maj± ulec rekombinacji, s± zazwyczaj przylegaj±ce do RSS o różnej długo¶ci odstępu (tzn. jeden ma „12RSS”, a drugi „23RSS”). Jest to ważna cecha w regulacji rekombinacji V(D)J.
ProcessEdit
Rekombinacja V(D)J rozpoczyna się, gdy rekombinaza V(D)J (poprzez aktywność RAG1) wiąże RSS flankujący kodujący segment genu (V, D, lub J) i tworzy jednoniciowy pseudonim w DNA pomiędzy pierwszą zasadą RSS (tuż przed heptamerem) a segmentem kodującym. Jest to zasadniczo energetycznie obojętne (nie wymaga hydrolizy ATP) i powoduje powstanie wolnej 3′ grupy hydroksylowej i 5′ grupy fosforanowej na tej samej nici. Reaktywna grupa hydroksylowa jest ustawiana przez rekombinazę tak, aby zaatakować wiązanie fosfodiestrowe przeciwnej nici, tworząc dwa końce DNA: spinkę do włosów (ang. stem-loop) na segmencie kodującym i tępy koniec na segmencie sygnałowym. Obecny model jest taki, że nicowanie DNA i tworzenie szpilki do włosów zachodzi na obu niciach jednocześnie (lub prawie tak) w kompleksie znanym jako centrum rekombinacji.
Tępe końce sygnałowe są spłukane razem, aby utworzyć okrągły kawałek DNA zawierający wszystkie sekwencje między segmentami kodującymi, znany jako złącze sygnałowe (chociaż okrągły w przyrodzie, to nie należy mylić z plazmidem). Chociaż pierwotnie uważano, że są one tracone podczas kolejnych podziałów komórkowych, istnieją dowody na to, że złącza sygnałowe mogą ponownie wejść do genomu i prowadzić do patologii poprzez aktywację onkogenów lub przerwanie funkcji genu supresorowego guza (s).
Końce kodujące są przetwarzane dalej przed ich ligacją przez kilka zdarzeń, które ostatecznie prowadzą do różnorodności złączy. Przetwarzanie rozpoczyna się, gdy DNA-PK wiąże się z każdym złamanym końcem DNA i rekrutuje kilka innych białek, w tym Artemis, XRCC4, ligazę DNA IV, Cernunnos i kilka polimeraz DNA. DNA-PK tworzy kompleks, który prowadzi do jego autofosforylacji, a w konsekwencji do aktywacji Artemisa. Końcówki kodujące szpilek do włosów są otwierane przez aktywność Artemisa. Jeśli są one otwierane w centrum, powstaje tępy koniec DNA; jednak w wielu przypadkach otwarcie następuje „poza centrum” i skutkuje pozostawieniem dodatkowych zasad na jednej nici (overhang). Są one znane jako nukleotydy palindromiczne (P) ze względu na palindromiczną naturę sekwencji powstałej podczas usuwania nawisu przez enzymy naprawcze DNA. Proces otwierania szpilki do włosów przez Artemis jest kluczowym etapem rekombinacji V(D)J i jest wadliwy w modelu mysim ciężkiego połączonego niedoboru odporności (scid).
Następnie XRCC4, Cernunnos i DNA-PK wyrównują końce DNA i rekrutują terminalną deoksynukleotydylotransferazę (TdT), niezależną od szablonu polimerazę DNA, która dodaje nie szablonowane (N) nukleotydy do końca kodującego. Dodawanie jest w większości przypadkowe, ale TdT wykazuje preferencję dla nukleotydów G/C. Podobnie jak w przypadku wszystkich znanych polimeraz DNA, TdT dodaje nukleotydy do jednej nici w kierunku od 5′ do 3′.
Na koniec, egzonukleazy mogą usuwać zasady z końców kodujących (w tym wszelkie nukleotydy P lub N, które mogły powstać). Polimerazy DNA λ i μ następnie wstawiają dodatkowe nukleotydy w razie potrzeby, aby dwa końce były zgodne do połączenia. Jest to proces stochastyczny, dlatego może wystąpić dowolna kombinacja dodawania nukleotydów P i N oraz usuwania egzonukleolitycznego (lub żadna). Wreszcie, przetworzone końce kodujące są ligowane razem przez ligazę DNA IV.
Wszystkie te procesy przetwarzania prowadzą do powstania paratopu, który jest wysoce zmienny, nawet gdy te same segmenty genu są rekombinowane. Rekombinacja V(D)J umożliwia wytwarzanie immunoglobulin i receptorów komórek T dla antygenów, z którymi ani organizm, ani jego przodek (przodkowie) nie musieli się wcześniej zetknąć, co pozwala na adaptacyjną odpowiedź immunologiczną na nowe patogeny, które się rozwijają lub na te, które często się zmieniają (np. grypa sezonowa). Jednakże, głównym zastrzeżeniem tego procesu jest to, że sekwencja DNA musi pozostać w ramce, aby zachować prawidłową sekwencję aminokwasów w końcowym produkcie białkowym. Jeśli powstająca sekwencja jest poza ramką, rozwój komórki zostanie zatrzymany, a komórka nie przetrwa do dojrzałości. Rekombinacja V(D)J jest zatem bardzo kosztownym procesem, który musi być (i jest) ściśle regulowany i kontrolowany.