Rozdzielczość osiowa

1.43.2 Przypadek technik mikroskopii superrozdzielczej

Rozdzielczość boczna i osiowa w mikroskopie świetlnym są zasadniczo ograniczone dyfrakcyjnie w związku między długością fali światła a aperturą lub kątem akceptacji obiektywu używanego do obrazowania, jak opisał Ernst Abbe w 1873 roku. W wymiarze poprzecznym ta granica rozdzielczości wynosi około 200 nm, a w wymiarze osiowym około 500 nm. Granica dyfrakcyjna w mikroskopii optycznej wynika z podstawowych ograniczeń optyki używanej do tworzenia obrazu. Jeśli rozważymy obraz formowany przez subrozdzielcze, sferyczne źródło światła, okaże się, że obraz, który powstaje nawet przy doskonale skorygowanej, wolnej od aberracji optyce mikroskopu, nie jest opisany przez prostą sferę. W rzeczywistości, obserwuje się złożony trójwymiarowy rozkład intensywności w punkcie ogniskowym, który może być matematycznie opisany przez funkcję rozrzutu punktu (PSF) (Rysunek 1). Centralne maksimum PSF zawiera 86,5% całkowitej dostępnej intensywności energii. Zarówno w wymiarze poprzecznym, jak i osiowym, pozostała energia intensywności jest mapowana na serię maksimów i minimów w sposób symetryczny rotacyjnie. To właśnie interakcja PSF z sąsiednich cech obrazu ostatecznie określa granicę rozdzielczości dyfrakcyjnej mikroskopu świetlnego.

Rysunek 1. Mapy intensywności XY (a) i XZ (b) idealnej funkcji rozrzutu punktu.

Gdy dwa obiekty zbliżają się do siebie w przestrzeni, ich PSF nakładają się na siebie i wkrótce nie można ich od siebie odróżnić. Minimalne nakładanie się dwóch PSF, które może być tolerowane przed utratą zdolności do odróżniania tych obiektów od siebie, zostało opisane jako punkt, w którym intensywność spada o około 25% pomiędzy dwoma PSF. Punkt, w którym ten spadek intensywności zostaje osiągnięty jest równoważny odległości pomiędzy centralnym maksimum a pierwszym minimum PSF. Bardzo trudno jest dokładnie wyznaczyć tę odległość, ponieważ trudno jest dokładnie umiejscowić minimum, a zamiast tego używa się współczynnika FWHM (full-width half-maximum) centralnego maksimum PSF.

Z obu równań widzimy, że rozdzielczość poprzeczna i osiowa zależy od apertury numerycznej układu optycznego zbierającego światło oraz od długości fali samego światła. Poprawa zdolności rozdzielczej wynika z zastosowania obiektywów o dużej aperturze numerycznej i krótszej długości fali świetlnej. Inne czynniki, takie jak względna jasność dwóch obiektów (kontrast) wpływają na tę minimalną rozdzielczą odległość. W praktyce, w obrazowaniu mikroskopowym, zarówno wystarczająca optyczna apertura numeryczna i wystarczający kontrast są niezbędne do dokładnego oglądania szczegółów subkomórkowych.

Obniżenie długości fali oświetlenia do zakresu ultrafioletu w celu poprawy rozdzielczości ogranicza wybór sond fluorescencyjnych i przesuwa granice poprawek optycznych i właściwości transmisyjnych toru optycznego mikroskopu. Dalsze komplikacje wynikają z zastosowania oświetlenia ultrafioletowego w badaniach żywych komórek, gdzie wielu badaczy zauważyło szkodliwy wpływ tej długości fali na długotrwałą żywotność komórek. Nowoczesne konstrukcje optyczne poprawiły apertury numeryczne soczewek, ale prawdziwa poprawa w tym zakresie nastąpiła dopiero po zastosowaniu egzotycznych materiałów montażowych i szkieł osłonowych. Obie te strategie nie udaje się zrobić więcej niż skromną poprawę w rozdzielczości i kosztem bycia niepraktyczne dla żywych badań komórkowych.

Biologiczna mikroskopia konfokalna, która wykorzystuje aperturę otworkową do poprawy kontrastu in-focus przez skuteczne usunięcie światła błądzącego z nieostrych płaszczyzn obiektu, stała się standardowym narzędziem obrazowania w badaniu relacji struktura-funkcja komórkowa . Poprawa wizualizacji płaszczyzny obrazu in-focus pozwala na łatwiejsze osiągnięcie praktycznych dyfrakcyjnych granic rozdzielczości przy krytycznym ustawieniu instrumentu. Teoretycznie, przy aperturach otworkowych mniejszych niż 1 jednostka Airy’ego, rozdzielczość boczna i osiowa faktycznie wzrasta do granicy 1,4 raza w stosunku do mikroskopu szerokopolowego. Jednak w praktyce średnice otworków mniejsze niż 1 jednostka Airy’ego dostarczają zbyt mało światła do obrazowania biologicznego, ponieważ znaczna część emisji w ognisku jest odrzucana przez otworki wraz z niepożądanym światłem nieostrym. W przypadku obrazowania biologicznego, gdzie zazwyczaj walczy się o uzyskanie sygnału emisji, odrzucenie części tego ograniczonego sygnału dla uzyskania niewielkiego przyrostu rozdzielczości jest niepraktyczne. W rzeczywistości, gdy sygnał emisji z próbki jest ograniczony, zwykle wybiera się otwory o średnicach większych niż 1 jednostka Airy’ego, aby zebrać więcej sygnału kosztem większej grubości warstwy optycznej. Przy tych średnicach otworków rozdzielczość mikroskopu konfokalnego jest zasadniczo taka sama jak konwencjonalnego szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego.

Nie oznacza to, że nie można wykrywać obiektów mniejszych niż granica rozdzielczości – wykrywanie nawet na poziomie pojedynczych cząsteczek jest możliwe, a obecnie stosunkowo proste przy użyciu nowoczesnych technologii detektorów. Całkowite usunięcie bezpośredniego oświetlenia wchodzącego do obiektywu w mikroskopii ciemnego pola tworzy doskonały kontrast, dzięki czemu nawet niewielka ilość światła rozproszonego przez obiekty o ograniczonej dyfrakcji, takie jak mikrotubule (o średnicy 25 nm) jest łatwo obserwowalna. Mikroskopia fluorescencyjna zapewnia również doskonałe warunki kontrastowe, które umożliwiają obserwację i rejestrację obiektów o wymiarach znacznie poniżej dyfrakcyjnej granicy rozdzielczości. W mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence), kontrast jest poprawiony w stosunku do standardowej szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej poprzez ograniczenie osiowego wzbudzenia do kilkuset nanometrów od interfejsu płyn-szkło, wykorzystując energię efanescencyjną światła bliskiego pola do wzbudzenia fluoroforu. W tych warunkach, nawet ruchliwość pojedynczych cząsteczek może być śledzona w czasie w bardzo cienkim przekroju optycznym. Jednak ani mikroskopia ciemnego pola, ani TIRF nie poprawia rozdzielczości układu optycznego – obie techniki polegają na dużych różnicach kontrastu między obiektem zainteresowania a tłem, aby umożliwić detekcję w subrozdzielczości.

Przesunięcie poza klasyczne granice rozdzielczości dyfrakcyjnej stanowiło wielkie wyzwanie w nowoczesnej mikroskopii świetlnej. Korzyści z poprawy naszej zdolności do rozstrzygania drobniejszych szczegółów z mikroskopu optycznego są oczywiste. Większa rozdzielczość pozwoliłaby na dokładniejszy opis strukturalny organizacji molekularnych fundamentalnych dla normalnej i nieprawidłowej fizjologii komórkowej i zachowania. Molekularne i biochemiczne sekcje tylko tak daleko w ujawnianiu złożoności w funkcjonalnych organizacji, takich jak te znajdujące się w kontaktach ogniskowych adhezji. Możliwość bezpośredniej wizualizacji, z rozdzielczością zbliżoną do wymiaru molekularnego, tych funkcjonalnych organizacji znacznie zwiększyłaby nasze zrozumienie molekularnych powiązań i zmian w organizacji związanych ze stanami funkcjonalnymi lub fizjologicznymi. Ostatnio wielu badaczy wykorzystało kilka różnych strategii, aby zapewnić znaczącą (2- do 10-krotną lub lepszą) poprawę klasycznej rozdzielczości bocznej i osiowej. Techniki te dzielą się na dwie ogólne kategorie: te, które opierają się na zmianach w oświetleniu próbki, oraz te, które wykorzystują strategie detekcji pojedynczych molekuł wraz z wymiarem czasowym do zbudowania superrozdzielczego obrazu.

Do celów niniejszego artykułu wybrano techniki, które doprowadziły do rozwoju i wprowadzenia komercyjnych instrumentów przez kilku producentów. Zastosowanie tego specyficznego kryterium w wyborze metod omawianych poniżej nie może być w żaden sposób interpretowane jako poparcie tych technik w stosunku do innych, które zostały wprowadzone do literatury. W miarę dalszego rozwoju prac w tej szybko zmieniającej się dziedzinie, może się okazać, że nowe metody i podejścia wyprzedzą te opisane poniżej. Jednakże, wprowadzenie tych komercyjnych instrumentów na rynek umożliwia szerokiemu gronu biologów z różnych dyscyplin zastosowanie metod superrozdzielczości do ich własnych specyficznych pytań biologicznych, wyprowadzając te metody z wyspecjalizowanych laboratoriów rozwojowych. Czytelnicy są zachęcani do samodzielnego zbadania wysokiej jakości obrazów zawartych w materiałach uzupełniających online towarzyszących wielu z cytowanych artykułów.