Tandemowa spektrometria mas

Fragmentacja jonów w fazie gazowej jest niezbędna w tandemowej spektrometrii mas i zachodzi pomiędzy różnymi etapami analizy mas. Istnieje wiele metod stosowanych do fragmentacji jonów, które mogą skutkować różnymi typami fragmentacji, a tym samym różnymi informacjami o strukturze i składzie cząsteczki.

Fragmentacja in-sourceEdit

Często proces jonizacji jest wystarczająco gwałtowny, aby pozostawić jony wynikowe z wystarczającą energią wewnętrzną do fragmentacji w spektrometrze mas. Jeśli jony produktu utrzymują się w stanie nierównowagowym przez umiarkowaną ilość czasu przed autodysocjacją, proces ten nazywany jest fragmentacją metastabilną. Fragmentacja w dyszy-skimmer odnosi się do celowego wywołania fragmentacji w źródle poprzez zwiększenie potencjału dyszy-skimmer w instrumentach opartych zazwyczaj na rozpylaniu elektrostatycznym. Chociaż fragmentacja in-source pozwala na analizę fragmentacyjną, nie jest to technicznie tandemowa spektrometria mas, chyba że jony metastabilne są analizowane masowo lub wybierane przed autodysocjacją, a drugi etap analizy jest wykonywany na powstałych fragmentach. Fragmentacja in-source może być stosowana zamiast tandemowej spektrometrii mas poprzez wykorzystanie technologii Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA), która generuje fragmentację bezpośrednio odpowiadającą danym z tandemowej spektrometrii mas. Fragmenty obserwowane przez EISA mają wyższą intensywność sygnału niż tradycyjne fragmenty, które ulegają stratom w komórkach kolizyjnych tandemowych spektrometrów mas. EISA umożliwia akwizycję danych fragmentacyjnych na analizatorach mas MS1, takich jak instrumenty typu time-of-flight i single quadrupole. Fragmentacja in-source jest często stosowana dodatkowo do tandemowej spektrometrii mas (z fragmentacją post-source), aby umożliwić dwa etapy fragmentacji w eksperymencie typu pseudo MS3.

Dysocjacja indukowana zderzeniamiEdit

Fragmentacja post-source jest najczęściej stosowana w eksperymencie tandemowej spektrometrii mas. Energia może być również dodana do jonów, które zazwyczaj są już wzbudzone wibracyjnie, poprzez zderzenia po źródle z neutralnymi atomami lub cząsteczkami, absorpcję promieniowania lub przeniesienie lub przechwycenie elektronu przez jon wielokrotnie naładowany. Dysocjacja indukowana zderzeniem (CID), zwana również dysocjacją aktywowaną zderzeniem (CAD), polega na zderzeniu jonu z neutralnym atomem lub cząsteczką w fazie gazowej i następującej po tym dysocjacji jonu. Na przykład, rozważ

AB + + M ⟶ A + B + + M {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}}

gdzie jon AB+ zderza się z neutralnym gatunkiem M, a następnie ulega rozpadowi. Szczegóły tego procesu opisywane są przez teorię zderzeń. Ze względu na różne konfiguracje instrumentalne, możliwe są dwa główne typy CID: (i) typu wiązkowego (w którym jony prekursorowe są fragmentowane w locie) oraz (ii) typu pułapki jonowej (w którym jony prekursorowe są najpierw pułapkowane, a następnie fragmentowane).

Trzecim i nowszym typem fragmentacji CID jest wyżejenergetyczna dysocjacja kolizyjna (HCD). HCD jest techniką CID specyficzną dla spektrometrów mas typu orbitrap, w których fragmentacja odbywa się poza pułapką jonową, zachodzi w celi HCD (w niektórych instrumentach nazywanej „multipolem trasowania jonów”). HCD jest fragmentacją typu pułapkowego, która, jak wykazano, posiada właściwości typu wiązkowego. Istnieją ogólnodostępne bazy danych wysokorozdzielczej tandemowej spektrometrii mas (np. METLIN z 850 000 wzorców molekularnych, z których każdy zawiera eksperymentalne dane CID MS/MS) i są one zazwyczaj wykorzystywane do ułatwienia identyfikacji małych cząsteczek.

Metody wychwytywania i przenoszenia elektronówEdit

Energia uwolniona, gdy elektron jest przenoszony do lub wychwytywany przez jon wielokrotnie naładowany, może indukować fragmentację.

Dysocjacja wychwytująca elektronyEdit

Jeśli elektron jest dodawany do wielokrotnie naładowanego jonu dodatniego, uwalniana jest energia Coulomba. Dodanie wolnego elektronu nazywa się dysocjacją przechwytującą elektrony (ECD) i przedstawia się następująco

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragmenty {{displaystyle ^{n+}+{e^{-}->}} left^{(n-1)+}right]^{*}{}}

dla wielokrotnie protonowanej cząsteczki M.

Dysocjacja z przeniesieniem elektronuEdit

Dodanie elektronu poprzez reakcję jon-jon nazywamy dysocjacją z przeniesieniem elektronu (ETD). Podobnie jak dysocjacja wychwytująca elektrony, ETD wywołuje fragmentację kationów (np. peptydów lub białek) poprzez przeniesienie na nie elektronów. Została wynaleziona przez Donalda F. Hunta, Joshuę Coona, Johna E. P. Syka i Jarroda Marto na Uniwersytecie Wirginii.

ETD nie wykorzystuje wolnych elektronów, lecz stosuje do tego celu aniony rodnikowe (np. antracen lub azobenzen):

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragmenty {{displaystyle ^{n+}+{A^{-}->}} lewa^{(n-1)+} prawa]^{*}+{{A->fragmenty}}

gdzie A jest anionem.

ETD rozszczepia losowo wzdłuż szkieletu peptydu (jony c i z), podczas gdy łańcuchy boczne i modyfikacje, takie jak fosforylacja, pozostają nienaruszone. Technika ta działa dobrze tylko dla jonów o wyższym stanie naładowania (z>2), jednak w porównaniu z dysocjacją indukowaną zderzeniem (CID), ETD jest korzystna dla fragmentacji dłuższych peptydów, a nawet całych białek. To sprawia, że technika ta jest ważna dla proteomiki top-down. Podobnie jak ECD, ETD jest efektywna dla peptydów z modyfikacjami takimi jak fosforylacja.

Dysocjacja z przeniesieniem elektronu i kolizją o wyższej energii (EThcD) jest połączeniem ETD i HCD, gdzie prekursor peptydowy jest początkowo poddawany reakcji jon/jon z anionami fluorantenu w liniowej pułapce jonowej, co generuje jony c- i z-. W drugim etapie do wszystkich jonów pochodzących z ETD stosuje się fragmentację HCD, aby wygenerować jony b- i y- przed ostateczną analizą w analizatorze orbitrap. Metoda ta wykorzystuje podwójną fragmentację do generowania bogatych w jony, a tym samym w dane widm MS/MS do sekwencjonowania peptydów i lokalizacji PTM.

Dysocjacja z ujemnym przeniesieniem elektronuEdit

Fragmentacja może również wystąpić z deprotonowanymi gatunkami, w których elektron jest przenoszony z gatunku na odczynnik kationowy w dysocjacji z ujemnym przeniesieniem elektronu (NETD):

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragmenty {{displaystyle ^{n-}+{ce {A+->}} lewa^{(n+1)-} prawa]^{*}+{ce {A->fragmenty}}

Po tym zdarzeniu przeniesienia, anion z niedoborem elektronów ulega wewnętrznej rearanżacji i fragmentacji. NETD jest jonowo-jonowym analogiem dysocjacji z oderwaniem elektronu (EDD).

NETD jest kompatybilny z fragmentacją peptydów i białek wzdłuż szkieletu przy wiązaniu Cα-C. Powstające fragmenty są zwykle a—. Powstające fragmenty są zwykle jonami produktowymi typu a– i x.

Dysocjacja elektronowo-detachmentowaEdit

Dysocjacja elektronowo-detachmentowa (EDD) jest metodą fragmentacji gatunków anionowych w spektrometrii mas. Służy ona jako ujemny tryb przeciwny do dysocjacji wychwytu elektronów. Ujemnie naładowane jony są aktywowane przez napromieniowanie elektronami o umiarkowanej energii kinetycznej. Rezultatem jest wyrzucenie elektronów z macierzystej cząsteczki jonowej, co powoduje dysocjację poprzez rekombinację.

Dysocjacja z przeniesieniem ładunkuEdit

Reakcja pomiędzy dodatnio naładowanymi peptydami i odczynnikami kationowymi, znana również jako dysocjacja z przeniesieniem ładunku (CTD), została ostatnio zademonstrowana jako alternatywna wysokoenergetyczna ścieżka fragmentacji dla peptydów o niskim stanie naładowania (1+ lub 2+). Proponowany mechanizm CTD z wykorzystaniem kationów helu jako reagentów jest następujący:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragmenty {displaystyle {{{1}+}+He+->}} lewa^{2}+} prawa]^{*}+{{He^{0}->fragmenty}}

Wstępne doniesienia mówią, że CTD powoduje rozszczepianie wiązań Cα-C w peptydach i dostarcza jonów produktowych typu a– i x.

FotodysocjacjaEdit

Energia wymagana do dysocjacji może być dodana przez absorpcję fotonu, co skutkuje fotodysocjacją jonów i jest reprezentowana przez

AB + + h ν ⟶ A + B + {{displaystyle {{AB+}+{h}}->{A}+B+}}}.

gdzie h ν {{displaystyle h}}

reprezentuje foton zaabsorbowany przez jon. Można stosować lasery ultrafioletowe, ale mogą one prowadzić do nadmiernej fragmentacji biomolekuł.

Dysocjacja wielofotonowa w podczerwieniEdit

Fotony podczerwone podgrzeją jony i spowodują dysocjację, jeśli wystarczająco dużo z nich zostanie zaabsorbowanych. Proces ten nazywany jest wielofotonową dysocjacją w podczerwieni (IRMPD) i jest często realizowany za pomocą lasera dwutlenku węgla i spektrometru mas z pułapkowaniem jonów, takiego jak FTMS.

Radiacyjna dysocjacja w podczerwieni ciała czarnegoEdit

Promieniowanie ciała czarnego może być wykorzystane do fotodysocjacji w technice znanej jako radiacyjna dysocjacja w podczerwieni ciała czarnego (BIRD). W metodzie BIRD, cała komora próżniowa spektrometru masowego jest ogrzewana w celu wytworzenia światła podczerwonego. BIRD wykorzystuje to promieniowanie do wzbudzania coraz bardziej energetycznych wibracji jonów, aż do momentu rozerwania wiązania i utworzenia fragmentów. Jest to podobne do podczerwonej dysocjacji wielofotonowej, która również wykorzystuje światło podczerwone, ale z innego źródła. BIRD jest najczęściej stosowany w spektrometrii masowej z jonowym rezonansem cyklotronowym z transformacją Fouriera.

Dysocjacja indukowana powierzchniowoEdit

W przypadku dysocjacji indukowanej powierzchniowo (SID), fragmentacja jest wynikiem zderzenia jonu z powierzchnią w warunkach wysokiej próżni. Obecnie, SID jest używany do fragmentacji szerokiej gamy jonów. Lata temu, powszechnie stosowano SID tylko do niższych mas, pojedynczo naładowanych gatunków, ponieważ metody jonizacji i technologie analizatorów mas nie były wystarczająco zaawansowane, aby prawidłowo formować, przenosić lub charakteryzować jony o wysokim m/z. Z czasem, samoskładające się powierzchnie monowarstwowe (SAM) złożone z CF3(CF2)10CH2CH2S na złocie stały się najczęściej używanymi powierzchniami kolizyjnymi dla SID w spektrometrze tandemowym. SAMs są najbardziej pożądanymi powierzchniami zderzeniowymi ze względu na ich charakterystycznie duże masy efektywne dla zderzania wchodzących jonów. Dodatkowo, powierzchnie te składają się ze sztywnych łańcuchów fluorowęglowych, które nie tłumią znacząco energii pocisku jonowego. Łańcuchy fluorowęglowe są również korzystne ze względu na ich zdolność do opierania się łatwemu przenoszeniu elektronów z powierzchni metalu na napływające jony. Zdolność SID do wytwarzania subkompleksów, które pozostają stabilne i dostarczają cennych informacji o łączności, jest nieporównywalna z żadną inną techniką dysocjacji. Ponieważ kompleksy powstałe w wyniku SID są stabilne i zachowują rozkład ładunku na fragmencie, daje to unikalne widmo, w którym kompleks skupia się wokół węższego rozkładu m/z. Produkty SID i energia, przy której się tworzą, odzwierciedlają siłę i topologię kompleksu. Unikalne wzory dysocjacji pomagają odkryć czwartorzędową strukturę kompleksu. Symetryczny rozkład ładunku i zależność dysocjacji są unikalne dla SID i sprawiają, że uzyskane widma różnią się od innych technik dysocjacji.

Technika SID jest również stosowana w spektrometrii masowej ruchliwości jonów (IM-MS). Trzy różne metody dla tej techniki obejmują analizę charakterystyki topologii, łączności międzypodjednostkowej i stopnia rozkładu struktury białek. Analiza rozkładu struktury białek jest najczęściej stosowanym zastosowaniem techniki SID. W spektrometrii mas IM-MS (Ion-mobility mass spectrometry), SID jest wykorzystywany do dysocjacji źródłowych aktywowanych prekursorów trzech różnych typów kompleksów białkowych: Białka C-reaktywnego (CRP), transtyretyny (TTR) i konkanawaliny A (Con A). Metoda ta jest wykorzystywana do obserwacji stopnia rozwinięcia każdego z tych kompleksów. Do tej obserwacji, SID pokazał struktury jonów prekursorowych, które istnieją przed zderzeniem z powierzchnią. IM-MS wykorzystuje SID jako bezpośrednią miarę konformacji dla każdej podjednostki białka.

Jonowy rezonans cyklotronowy z transformacją Fouriera (FTICR) jest w stanie zapewnić ultra-wysoką rozdzielczość i wysoką dokładność masy do instrumentów, które wykonują pomiary masy. Te cechy sprawiają, że spektrometry mas FTICR są użytecznym narzędziem do wielu różnych zastosowań, takich jak kilka eksperymentów dysocjacyjnych, takich jak dysocjacja indukowana zderzeniem (CID), dysocjacja z przeniesieniem elektronu (ETD) i inne. Dodatkowo, dysocjacja indukowana powierzchniowo została zaimplementowana w tym urządzeniu do badania fundamentalnej fragmentacji peptydów. W szczególności, SID został zastosowany do badań nad energetyką i kinetyką fragmentacji w fazie gazowej w urządzeniu ICR. Podejście to zostało wykorzystane do zrozumienia fragmentacji w fazie gazowej protonowanych peptydów, nieparzystoelektronowych jonów peptydowych, niekowalencyjnych kompleksów ligand-peptyd oraz ligowanych klastrów metali.