Identification, Characterization, and Verification of Proteins 130 and 131 as 14-3-3
Figure 1.
Figura 1. Regions of Silver-Stained Gels Showing Protein Spots 130 and 131 after Two-Dimensional Electrophoresis.
Panel A pokazuje normalny płyn mózgowo-rdzeniowy, z plamami 130 i 131 nieobecnymi. Panel B pokazuje płyn mózgowo-rdzeniowy od pacjenta z chorobą Creutzfeldta-Jakoba; strzałki wskazują na plamy 130 i 131. Żele w panelach C i D pochodzą z ekstraktu z normalnego ludzkiego mózgu. Panele A, B i C pokazują ten sam region żelu, z punktami izoelektrycznymi w zakresie od 4,8 do 6,0 (od lewej do prawej) na osi x i rozmiarami w zakresie od 10 do 40 kd (od dołu do góry) na osi y. Przerywana ramka w panelu C zakreśla region pokazany w panelu D z żelu o zakresie pH od 4,5 do 5,4. Strzałki w panelach B i C wskazują lokalizację plamek 130 i 131, które są oznaczone w panelu D.
Wyniki elektroforezy dwuwymiarowej do wykrywania białek płynu mózgowo-rdzeniowego 130 i 131 u pacjentów z chorobą Creutzfeldta-Jakoba są przedstawione na Figurze 1A i Figurze 1B. Ostatnie ulepszenia techniczne doprowadziły do zwiększenia rozdzielczości, z sześcioma plamami zamiast dwóch (odpowiadających białkom 130 i 131) pierwotnie opisanych. Aby znaleźć obfite źródło tych białek, zbadaliśmy normalną tkankę mózgową, aby określić, czy jakiekolwiek białka mózgowe znajdują się w pobliżu konstelacji plamek odpowiadających białkom płynu mózgowo-rdzeniowego 130 i 131. Figura 1C pokazuje region żelu barwionego srebrem po dwuwymiarowej elektroforezie normalnych białek mózgowych. Kilka białek pojawia się w tym samym obszarze co konstelacja 130-131, w tym dwa, które mają taki sam ładunek i masę jak konstelacja 130-131 w płynie mózgowo-rdzeniowym. Identyfikacja tych dwóch plamek na podstawie ich położenia została potwierdzona badaniami komigracyjnymi. Plamka 130 została oczyszczona przez elektroforezę dwuwymiarową o wąskim zakresie (zakres pH, 4,5 do 5,4), jak pokazano na rysunku 1D.
Splamka 130 została wycięta z 10 plamek, enzymatycznie strawiona i poddana mikrosekwencjonowaniu. Sekwencje aminokwasowe uzyskano z czterech fragmentów peptydowych. Trzy z tych sekwencji, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys, i Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, pasowały do sekwencji ludzkiego białka 14-3-3, izoformy eta. Czwarta sekwencja, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, pasowała do bydlęcego białka 14-3-3, izoformy gamma.
Przeciwciało 14-3-3 reagowało specyficznie z białkami płynu mózgowo-rdzeniowego 130 i 131 na dwuwymiarowym elektroforetycznym immunoblocie, ale nie reagowało z innymi białkami płynu mózgowo-rdzeniowego, w ten sposób weryfikując, że białka płynu mózgowo-rdzeniowego 130 i 131 są białkami 14-3-3.
14-3-3 Immunoassay
Rysunek 2.
Figura 2. Immunostaining for Anti-14-3-3β Polyclonal Rabbit Antibody after Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide-Gel Electrophoresis.
Pas 1 przedstawia płyn mózgowo-rdzeniowy od pacjenta z patologicznymi dowodami choroby Alzheimera, pasy 2 i 3 przedstawiają płyn mózgowo-rdzeniowy od dwóch pacjentów z chorobą Creutzfeldta-Jakoba, pas 4 przedstawia płyn mózgowo-rdzeniowy od normalnej krowy, pas 5 przedstawia płyn mózgowo-rdzeniowy od krowy z eksperymentalnie wywołaną pasażowalną encefalopatią norek i patologicznymi dowodami choroby gąbczastej, pas 6 przedstawia normalną surowicę ludzką, pas 7 przedstawia surowicę od pacjenta z chorobą Creutzfeldta-Jakoba, pas 8 przedstawia wyciąg z normalnego mózgu ludzkiego, a pas 9 przedstawia oczyszczone białko prionowe z mózgu pacjenta z chorobą Creutzfeldta-Jakoba.
Odkrycie, że plamy 30-kd w płynie mózgowo-rdzeniowym (białka 130 i 131) są białkami 14-3-3 doprowadziło do opracowania prostego testu immunologicznego pomocnego w diagnostyce pasażowalnej encefalopatii gąbczastej. Jak pokazuje Figura 2, w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z chorobą Creutzfeldta-Jakoba stwierdzono immunoreaktywne pasmo 30-kd (pasy 2 i 3), podczas gdy takiego pasma nie wykryto w płynie mózgowo-rdzeniowym od zdrowych kontroli (dane nie pokazane) lub od pacjenta z chorobą Alzheimera (pas 1). Jak oczekiwano, 14-3-3 był obfity w ekstrakcie normalnego ludzkiego mózgu (pas 8). białko 14-3-3 nie zostało znalezione w normalnej surowicy (pas 6); jednak nie wykryto go również w surowicy od pacjentów z chorobą Creutzfeldta-Jakoba (pas 7). Białko prionowe oczyszczone z mózgu pacjenta z chorobą Creutzfeldta-Jakoba (pas 9) nie reagowało krzyżowo z przeciwciałem 14-3-3, potwierdzając, że 14-3-3 nie jest białkiem prionowym.
Tabela 1.
Tabela 1. Cerebrospinal Fluid Samples Evaluated with the 14-3-3 Immunoassay, According to Diagnosis. Tabela 2.
Tabela 2. Sensitivity and Specificity of the 14-3-3 Immunoassay for Creutzfeldt-Jakob Disease.
Sześćdziesiąt osiem z 71 próbek płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów z chorobą Creutzfeldta-Jakoba (96 procent) było pozytywnych dla 14-3-3 (Tabela 1 i Tabela 2). Cztery z 94 próbek (4 procent) od pacjentów z innymi chorobami obejmującymi demencję były pozytywne dla 14-3-3 (Tabela 1 i Tabela 2) (P<0,001). Ponadto, gdy pacjenci z demencją, o których wiadomo, że mieli ostre zawały mózgu w ciągu jednego miesiąca przed badaniem, zostali wykluczeni z analizy, tylko 1 z 91 próbek (1 procent) była pozytywna (P<0,001). Próbki od wszystkich 10 pacjentów z otępieniem wielozawałowym, ale bez udarów w ciągu miesiąca przed testowaniem, były negatywne dla 14-3-3. Pojedynczy fałszywie dodatni wynik wśród próbek płynu mózgowo-rdzeniowego od innych pacjentów z demencją pochodził od pacjenta z kliniczną diagnozą choroby Alzheimera, która nie została zweryfikowana przez badania patologiczne.
14-3-3 wykryto w 18 z 66 próbek płynu mózgowo-rdzeniowego (27 procent) od pacjentów z innymi chorobami neurologicznymi nie obejmującymi demencji. Te 18 pozytywnych próbek pochodziło od pacjentów z ostrym wirusowym zapaleniem mózgu, udarem (bez demencji) w ciągu jednego miesiąca przed badaniem, krwotokiem podpajęczynówkowym lub zespołem Retta. Choroba Creutzfeldta-Jakoba nie mogła być włączona do diagnostyki różnicowej żadnego z tych zaburzeń.
Ogółem, czułość testu immunologicznego 14-3-3 jako markera dla choroby Creutzfeldta-Jakoba wynosiła 96 procent (68 prawdziwie pozytywnych wyników podzielonych przez 71 prawdziwie pozytywnych i fałszywie negatywnych wyników; 95 procent przedziału ufności, 92 do 99 procent), a swoistość wynosiła 88 procent (164 prawdziwie negatywnych wyników podzielonych przez 186 prawdziwie negatywnych i fałszywie pozytywnych wyników; 95 procent przedziału ufności, 84 do 92 procent). Co ważniejsze, swoistość tego testu wśród wszystkich pacjentów z demencją wynosiła 96 procent (90 prawdziwie negatywnych wyników podzielonych przez 94 prawdziwie negatywne i fałszywie pozytywne wyniki; 95 procent przedziału ufności, 90 do 96 procent), a gdy trzech pacjentów z demencją i zawałem mózgu w ciągu jednego miesiąca przed testowaniem zostało wykluczonych, swoistość testu immunologicznego wynosiła 99 procent (90 prawdziwie negatywnych wyników podzielonych przez 91 prawdziwie negatywnych i fałszywie pozytywnych wyników; 95 procent przedziału ufności, 97 do 100 procent) (Tabela 1 i Tabela 2).
Porównanie elektroforezy dwuwymiarowej i testu immunologicznego
Tabela 3.
Tabela 3. Comparison of Two-Dimensional Electrophoresis for Proteins 130 and 131 and the 14-3-3 Immunoassay.
Porównaliśmy dwuwymiarowe elektroforetyczne oznaczenie dla białek 130 i 131 z testem immunologicznym 14-3-3 w 50 próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego (Tabela 3). Trzynaście z 15 próbek od pacjentów z chorobą Creutzfeldta-Jakoba było pozytywnych z obydwoma testami, a pozostałe 2 próbki były negatywne dla białek 130 i 131, ale pozytywne dla białka 14-3-3. Wyniki obu testów były takie same w próbkach od pacjentów z demencją nie związaną z chorobą Creutzfeldta-Jakoba lub innymi zaburzeniami neurologicznymi. Chociaż swoistości obu testów są podobne, test immunologiczny 14-3-3 ma nieco wyższą czułość.
14-3-3 Immunoassay in Animals
Tabela 4.
Tabela 4. Wyniki oznaczenia immunologicznego 14-3-3 w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego od zwierząt.
Wyniki badań u zwierząt były zgodne z wynikami badań u ludzi. Rysunek 2 przedstawia wyniki oznaczenia w płynie mózgowo-rdzeniowym od normalnej krowy (pas 4) i krowy z patologicznymi dowodami pasażowalnej encefalopatii gąbczastej (pas 5). Jak pokazuje Tabela 4, białko 14-3-3 zostało wykryte w płynie mózgowo-rdzeniowym od sześciu z dziewięciu sztuk bydła z eksperymentalnie wywołaną pasażowalną encefalopatią norki lub trzęsawką. Jedna krowa z cechami klinicznymi, ale bez patologicznych dowodów pasażowalnej encefalopatii gąbczastej również miała pozytywny wynik testu. Żadne bydło kontrolne nie miało pozytywnych testów. Test był pozytywny u pięciu z sześciu owiec z naturalnie nabytą trzęsawką i był negatywny u jednej owcy kontrolnej. Wszystkie 15 doświadczalnie zakażonych szympansów miało pozytywne testy, podczas gdy żaden z 77 szympansów kontrolnych nie miał pozytywnego testu. Ogólna czułość testu immunologicznego 14-3-3 u zwierząt wynosiła 87 procent, a ogólna swoistość 99 procent.
.