Abstract
Fosforylaza glikogenu jest ważnym enzymem dla metabolizmu węglowodanów w mięśniach. Wykorzystuje ona nieorganiczny fosforan do usuwania glukozy z glikogenu, wytwarzając glukozo-1-fosforan, który może być wykorzystany do produkcji ATP. Nieaktywna fosforylaza glikogenu (fosforylaza h) jest aktywowana albo przez allosteryczne wiązanie 5′-AMP, albo przez fosforylację przez kinazę fosforylową (PhK). W wyniku fosforylacji powstaje fosforylaza a, która jest aktywna przy braku AMP. PhK jest jedyną kinazą, która może fosforylować fosforylazę b, która z kolei jest jedynym substratem dla PhK. Wszystkie mutanty były badane pod kątem zmian w ich interakcji z okrojoną formą katalitycznej podjednostki kinazy fosforylowej, gamma(1–300). Trzy mutacje (R69K, R69E i E501A), dokonane w miejscach, które oddziałują z aminowym końcem fosforylazy b lub a, wykazały niewielką różnicę w fosforylacji przez gamma(1–300) w porównaniu z fosforylazą b. Pięć mutacji, dokonanych w trzech miejscach w amino-końcowym ogonie fosforylazy (K11A, K11E, I13G, R16A i R16E), spowodowało jednak spadek wydajności katalitycznej dla gamma(1–300) w porównaniu z fosforylazą b. R16E była najuboższym substratem dla gamma(1–300), dając 47-krotny spadek wydajności katalitycznej. Amino-końcówka, a szczególnie Arg 16, są bardzo ważnymi czynnikami w rozpoznawaniu fosforylazy przez gamma(1–300). Ponadto, I13G i R16A były zdolne do fosforylacji przez kinazę białkową A, która nie rozpoznaje natywnej fosforylazy; U niektórych z mutantów zaobserwowano również zmienione stany konformacyjne. R16A i R16E były aktywowane przy bardzo niskim stężeniu AMP i krystalizowały się w niskiej temperaturze, jak fosforylaza a. Wskazuje to, że nawet bez fosforylacji ich struktury są bardziej podobne do fosforylazy a niż fosforylazy b. Dwie inne mutacje dawały odwrotny efekt, zachowując się jak fosforylaza b po fosforylacji. R69E był tylko częściowo aktywowany przez fosforylację, a I13G był całkowicie nieaktywny po fosforylacji. I13G była pierwszą obserwacją formy fosforylazy, która nie mogła być aktywowana przez fosforylację.