Transformacja kwasowa nordiazepamu może wpływać na oszacowanie odzysku podczas analizy śladowej diazepamu i nordiazepamu w próbkach wody środowiskowej metodą chromatografii cieczowej-tandemowej spektrometrii mas

Systemy chromatografii cieczowej-tandemowej kwadrupolowej spektrometrii mas

Opracowane systemy elucji izokratycznej jak i gradientowej dały dobrą rozdzielczość pików (Rs ≥ 3,1) dla diazepamu i nordiazepamu. W systemie izokratycznym, czasy retencji wynosiły 2,6 min (0,54 RSD %) i 4,1 min (0,27 RSD %) dla wzorców nordiazepamu-d5 i diazepamu-d5, odpowiednio. W matrycy wody powierzchniowej czasy retencji były takie same jak dla wzorców, a wartości RSD wynosiły 0,62% i 0,30% odpowiednio dla nordiazepamu-d5 i diazepamu-d5. Czasy retencji dla wzorców roboczych w systemie gradientowym wynosiły 2,4 min (0,90 RSD %) i 2,9 min (0,70 RSD %) odpowiednio dla nordiazepamu i diazepamu. Precyzję czasów retencji dla związków w ściekach oczyszczonych przedstawiono w tabeli 1, gdzie wartości RSD wynosiły ≤ 0,35%.

Diazepam i nordiazepam zidentyfikowano w próbkach ścieków oczyszczonych na podstawie charakterystycznych przejść MS/MS i czasów retencji (tabela 1). Dla każdego związku monitorowano jeden jon prekursorowy i dwa jony fragmentacyjne. W celu identyfikacji „naturalnie” występujących diazepamu i nordiazepamu, porównano stosunek powierzchni pików uzyskanych z dwóch jonów fragmentacyjnych z powierzchniami wzorców (Tabela 1). Również czasy retencji dla związków docelowych zostały porównane z czasami retencji dla diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 w tym samym przebiegu chromatograficznym.

Opracowanie metody ekstrakcji do fazy stałej

Stabilność diazepamu i nordiazepamu w kwaśnych i obojętnych próbkach wodnych

Zbierane próbki wody środowiskowej są powszechnie przechowywane w kwaśnym pH przed analizą pojawiających się zanieczyszczeń. W niniejszej pracy badano stabilność diazepamu i nordiazepamu przechowywanych jako wzorce robocze (przy pH 3,1 i pH 7,0). Stwierdzono, że nordiazepam ulega znacznej degradacji podczas przechowywania w kwaśnym roztworze w temperaturze pokojowej. W ciągu 12 dni, 56% nordiazepamu uległo degradacji (Rys. 2). Degradacja nie była tak znaczna, gdy roztwór roboczy przechowywano w temperaturze 4 °C; po 12 dniach degradacji uległo 20% początkowego stężenia nordiazepamu. Z drugiej strony, diazepam okazał się stabilny w pH 3,1 podczas przechowywania w temperaturze pokojowej i w 4 °C (Rys. 2). W ciągu 12 dni tylko 0,53% i 3,1% diazepamu uległo degradacji odpowiednio w temperaturze pokojowej i w 4 °C. Wykazano, że oba związki były stabilne przez 12 dni w neutralnym pH. W 12 dniu, odpowiedzi dla diazepamu i nordiazepamu (podczas przechowywania w 4 °C i temperaturze pokojowej) wynosiły 101-103% początkowych odpowiedzi. Wartości RSD (n = 3) dla oznaczanych stężeń w różnych punktach czasowych wynosiły ≤ 5,1%. Reakcja została wstępnie odkryta w próbkach ścieków, ale eksperymenty przeprowadzono w przygotowanych roztworach w celu uproszczenia warunków i zmniejszenia możliwości wystąpienia innych reakcji/efektów w bardzo złożonych matrycach ścieków.

Stabilność diazepamu i nordiazepamu w 5 mM kwasie mrówkowym w wodzie oczyszczonej, pH 3. Diazepam przechowywany w 4 °C (biały trójkąt) i w temperaturze pokojowej (czarny trójkąt). Nordiazepam przechowywany w temperaturze 4 °C (biały kwadrat) i w temperaturze pokojowej (czarny kwadrat). Szczegóły eksperymentalne opisano w „Badania stabilności diazepamu i nordiazepamu w kwaśnych i obojętnych roztworach wodnych”

Nasze wyniki pokazują, że nordiazepam jest niestabilny przy pH 3, wyniki te są zgodne z wynikami w literaturze, które pokazują, że nordiazepam ulega hydrolizie w roztworach kwaśnych. Archontaki i wsp. stwierdzili, że nordiazepam ulega hydrolizie w kwaśnych roztworach wodnych i że pierwszy etap degradacji jest odwracalny. Jednakże wyniki niniejszego badania mogą wydawać się sprzeczne z wynikami niedawno przeprowadzonego badania, w którym stwierdzono, że nordiazepam (i diazepam) są bardziej stabilne w pH 2 niż w pH 7 . Różnica ta jest właściwie oczekiwana, jeśli weźmie się pod uwagę różne strategie oznaczania odzysku. Ponieważ przemiana nordiazepamu ulega odwróceniu podczas odparowywania i ogrzewania, może to nie mieć żadnego praktycznego znaczenia dla rutynowego stosowania metody. Dopiero gdy odzysk jest szacowany zgodnie z zaleceniami Matuszewskiego et al. w połączeniu z niestabilnością nordiazepamu przy niskim pH, otrzymujemy utratę związku i tym samym pozornie wysoki odzysk.

Odzyski z ekstrakcji w fazie stałej dla symulowanych próbek wody środowiskowej, przechowywanych przy niskim pH próbki

Odzyski z ekstrakcji w fazie stałej i efekt matrycy zostały określone w próbkach wody oczyszczonej metodą LC-MS z zastosowaniem podejścia zaproponowanego przez Matuszewskiego et al. , szczegóły podano w „Walidacji metody”. Odzysk z ekstrakcji został określony dla wzorców znakowanych izotopami, diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5, ponieważ nie oczekuje się, że znakowane związki znajdą się w matrycach środowiskowych. W obecnym badaniu, wzorce robocze diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 były przechowywane w 5 mM kwasie mrówkowym w oczyszczonej wodzie pH 3.1/acetonitryl (90/10, v/v), nie dłużej niż 1 tydzień w temperaturze 8 °C, i zostały użyte do przygotowania zestawów A-C.

Względne odzyski ekstrakcji, określone przy jednym niskim i jednym wysokim stężeniu, są podane w tabeli 2 (metoda ekstrakcji jest podana w „Przygotowanie próbki i ekstrakcja do fazy stałej”). Odzysk ekstrakcji był wyższy dla nordiazepamu-d5 niż dla diazepamu-d5. W przypadku nordiazepamu-d5 względny odzysk z ekstrakcji wynosił 114 ± 8,1% i 117 ± 21% odpowiednio przy niskim i wysokim stężeniu. Wartości RSD uzyskane dla diazepamu-d5 wynosiły 6,0% i 24% odpowiednio dla niskiego i wysokiego stężenia (Tabela 2). Wysokie wartości RSD (≥ 18%) dla procedury ekstrakcji do fazy stałej są czasami uzyskiwane przy oznaczeniach na poziomie śladów w złożonych matrycach. Ponadto, wysokie odzyski ekstrakcji (≥ 100%) dla nordiazepamu w próbkach wody środowiskowej zostały wcześniej zgłoszone w literaturze . Jak zostanie omówione poniżej, wysokie odzyski mogą być skorelowane z równowagą chemiczną między nordiazepamem a produktem przemiany.

Bezwzględny odzysk z ekstrakcji dla nordiazepamu-d5 został określony na 139 ± 21%, a efekt matrycy na 119 ± 3,0%. Wysoki bezwzględny odzysk ekstrakcji dla nordiazepamu-d5 może być częściowo wyjaśniony przez fakt, że nordiazepam-d5 podlegał wzmocnieniu jonowemu w interfejsie MS. Jednakże wykazaliśmy, że wysokie odzyski ekstrakcji (> 100% dla względnej ekstrakcji, jak omówiono powyżej) nie były spowodowane jedynie efektami matrycy w źródle ESI. Przesądziły o tym względne odzyski ekstrakcji uzyskane wg Matuszewskiego i wsp. gdzie próbki ekstrahowane i nieekstrahowane wstrzykiwano do systemu LC-MS/MS rozpuszczone w tej samej matrycy. Dodatkowo, w celu dalszego zweryfikowania, że wysokie odzyski ekstrakcyjne nie były skorelowane z żadnym procesem zachodzącym w interfejsie spektrometru mas, odzyski ekstrakcyjne dla diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 zostały określone przy użyciu drugiej techniki detekcji, LC-UV. Odzysk dla jednej ekstrahowanej próbki nordiazepamu-d5 w buforze fosforanowym (pH 7.0) analizowanej zarówno przy użyciu LC-MS/MS jak i LC-UV wynosił odpowiednio 159 i 153% (n = 2). Stwierdziliśmy, że wysokie odzyski ekstrakcyjne dla nordiazepamu nie były przypisane, w dużym stopniu, żadnemu procesowi w spektrometrze mas.

W podsumowaniu, nawet jeśli uzyskane odzyski ekstrakcyjne i wartości RSD były wysokie, prawdopodobnie wydawałyby się uzasadnione, ponieważ stężenia związków docelowych były niskie (50 i 250 pM) i ponieważ związki były ekstrahowane ze złożonej matrycy. W tym badaniu chcieliśmy wykazać, że te wysokie odzyski uzyskane dla nordiazepamu mogą być skorelowane z równowagą chemiczną między nordiazepamem a produktem transformacji znalezionym przez Archontaki i wsp. .

Regeneracja nordiazepamu podczas przygotowywania próbki

Gdy przechowywane roztwory diazepamu i nordiazepamu (pH 3.1, w temperaturze pokojowej, „Stabilność diazepamu i nordiazepamu w kwaśnych i obojętnych próbkach wodnych”) zostały użyte do spikowania buforu fosforanowego, a następnie poddane ekstrakcji do fazy stałej, odpowiedzi uzyskane z odtworzonych ekstraktów nordiazepamu były większe w porównaniu z odpowiedziami uzyskanymi z nieekstrahowanych przechowywanych roztworów. W wyniku ekstrakcji do fazy stałej powierzchnia piku nordiazepamu zwiększyła się z 26 jednostek powierzchni (2,7 RSD %, n = 3) do 45 jednostek powierzchni (14,6 RSD %, n = 3).

W celu sprawdzenia, czy nordiazepam został zregenerowany podczas ekstrakcji do fazy stałej, jedna przechowywana próbka nordiazepamu-d5 (dająca powierzchnię piku 1470 dla jonu fragmentu m/z 213) i jedna przetworzona próbka nordiazepamu-d5 (z powierzchnią piku 1790) zostały wstrzyknięte do systemu LC-MS/MS. Oprócz kanału SRM dla nordiazepamu-d5 (276 → 213), pozyskano dwa dodatkowe kanały SRM, Tabela 1. Wstrzyknięto przechowywane próbki nordiazepamu-d5 (n = 6) i określono stosunek przejść SRM jako 1,4 (3,8 RSD %, stosunek jonów fragmentu m/z (276 → 213)/(276 → 165) i 1,0 (3,5 RSD %, stosunek jonów fragmentu m/z (276 → 213)/(276 → 140). Dla przetworzonej próbki nordiazepamu-d5, stosunki przejść SRM były takie same, tj. 1,4 i 1,0. Tak więc nie było znaczących różnic w stosunkach jonów fragmentacyjnych pomiędzy przechowywanymi i przetworzonymi próbkami. Co więcej, czasy retencji były takie same dla obu próbek. Stwierdzono, że to nordiazepam-d5 został wykryty zarówno w przechowywanych, jak i przetworzonych próbkach.

Archontaki i wsp. stwierdzili, że nordiazepam został przekształcony w kwaśnym roztworze wodnym, w produkt pośredni N-(2-benzoilo-4-chlorofenylo)-2-aminoacetamid o wzorze cząsteczkowym C15H13N2O2Cl i masie monoizotopowej 288,1 Da. Produkt transformacji skrystalizowano i poddano analizie LC-UV, GC-MS, 1H- i 13C-NMR oraz spektroskopii IR. Równowaga chemiczna półproduktu i nordiazepamu była odwracalna, ale dalsza transformacja półproduktu do końcowego produktu rozkładu (C13H10NOCl) nie była odwracalna. W obecnym badaniu, jon o czasie retencji 3,0 min i stosunku masy do ładunku 289,0 został wykryty przez LC-MS w przechowywanym roztworze (pH 3,1) nordiazepamu. Ten jon może odpowiadać + produktu przemiany nordiazepamu. Ponadto wzór izotopowy dla jonu w 3.0 min odpowiadał wzorowi izotopowemu dla jednego atomu chloru. Ponadto pik chromatograficzny eluował przed nordiazepamem, co jest zgodne z wynikami rozdzielania nordiazepamu i N-(2-benzoilo-4-chlorofenylo)-2-aminoacetamidu w układzie fazy odwróconej stosowanym przez Archontaki i wsp. Zatem pik wykryty w przechowywanym roztworze wody kwaśnej w tym badaniu był najprawdopodobniej N-(2-benzoilo-4-chlorofenylo)-2-aminoacetamidem. Ponadto, stosunek powierzchni piku nordiazepamu do N-(2-benzoilo-4-chlorofenylo)-2-aminoacetamidu wynosił 0,75 (n = 2) w tym przechowywanym roztworze wodnym w prezentowanym badaniu. W odparowanych mieszaninach metanolu (szczegóły eksperymentalne opisane w „Badania stabilności diazepamu i nordiazepamu w kwaśnych i obojętnych roztworach wodnych”), stosunek powierzchni piku nordiazepamu do N-(2-benzoilo-4-chlorofenylo)-2-aminoacetamidu wzrósł jednak do 1,9 (6,8 RSD %, n = 4), tj, powierzchnia piku nordiazepamu zwiększyła się, a powierzchnia piku N-(2-benzoilo-4-chlorofenylo)-2-aminoacetamidu zmniejszyła się w porównaniu z próbką, która nie została odparowana. W próbce ślepej nie wykryto żadnych pików dla N-(2-benzoilo-4-chlorofenylo)-2-aminoacetamidu ani nordiazepamu. Wyniki te silnie sugerują, że równowaga chemiczna nordiazepamu i produktu transformacji nordiazepamu, scharakteryzowanego przez Archontaki et al. przesunęła się z N-(2-benzoilo-4-chlorofenylo)-2-aminoacetamidu do postaci nordiazepamu podczas odparowywania ekstraktów SPE. Nie wykryto żadnego piku, który można by skorelować z końcowym produktem rozkładu (C13H10NOCl) nordiazepamu.

Wyciągnięto wniosek, że nordiazepam łatwo przekształcał się w N-(2-benzoilo-4-chlorofenylo)-2-aminoacetamid w kwaśnym roztworze wodnym. Co ciekawe, nordiazepam był regenerowany podczas procesu ekstrakcji do fazy stałej. Tak więc, stosując przechowywane roztwory nordiazepamu o pH 3,0 jako odniesienie w obliczeniach odzysku ekstrakcyjnego, odzysk ekstrakcyjny jest przeszacowany. Wyniki te mają znaczenie podczas walidacji metody, tj. podczas oceny warunków przechowywania, odzysku ekstrakcyjnego i efektów matrycy. Ponadto przekształcenie nordiazepamu może mieć wpływ na ogólne wyniki analityczne, jeżeli jako wzorzec wewnętrzny nie jest stosowany analog nordiazepamu znakowany izotopem. Należy również podkreślić, że transformacja nordiazepamu może mieć wpływ na dokładność metody, nie tylko podczas przechowywania przed ekstrakcją do fazy stałej, ale również w zależności od pH stosowanego roztworu, np. rekonstytucji wysuszonych ekstraktów SPE.

Weryfikacja metody

Opracowana metoda została zwalidowana przez zastosowanie znakowanych izotopem analogów, diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 („Walidacja metody”), ponieważ związki te nie zostały wykryte w próbkach środowiskowych. Zaletą wykorzystania znakowanych analogów do walidacji metody jest to, że metoda może zostać zwalidowana na poziomach śladowych w rzeczywistej matrycy, w której oznaczane są ilościowo anality. Względne odzyski ekstrakcji w próbkach ścieków oczyszczonych wynosiły ≥ 87% dla diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 przy wysokim i niskim stężeniu (Tabela 3). Uzyskane wartości mieszczą się w zakresie tego, czego można się spodziewać, gdy śladowe stężenia farmaceutyków są ekstrahowane ze złożonych matryc. Bezwzględne odzyski ekstrakcyjne były niższe i wynosiły 63-86%, ponieważ analitów poddano supresji jonowej (Tabela 3). Przy niskim stężeniu, efekty matrycy (ME %) wynosiły 76 ± 14% i 88 ± 14%, odpowiednio dla diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 (Tabela 3). Przy wysokim stężeniu efekt matrycy i wartości RSD mieściły się w tym samym zakresie, co przy niskim stężeniu. Te wartości ME % mieszczą się w dopuszczalnym zakresie, ponieważ wyniki innych badań wskazują, że efekt matrycy uzyskany w matrycach wody środowiskowej może być stosunkowo wysoki. Dokładność metody została określona przez oznaczenie odzysku SPE przy niskim i wysokim stężeniu diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 (tabela 3). Odzysk względny wynosił 88 ± 7,6% i 87 ± 12% dla diazepamu-d5 odpowiednio przy niskim i wysokim stężeniu oraz 98 ± 7,8% i 99 ± 6,1% dla nordiazepamu-d5.

Precyzja układu chromatograficznego, wyrażona jako wartości RSD czasów retencji uzyskanych dla diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 w ekstrahowanych próbkach ścieków, wynosiła ≤ 0,62%. Wartości RSD powierzchni pików dla diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 w próbkach ścieków ekstrahowanych wynosiły ≤ 7,8% („The liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry systems”). Ponadto liniowość, wyrażona jako współczynnik korelacji (R2) krzywych kalibracyjnych w oczyszczonych próbkach ścieków, wynosiła 0,988 i 0,957 odpowiednio dla diazepamu i nordiazepamu.

W tym badaniu nie zaobserwowano przenoszenia w systemie LC-MS/MS, ponieważ w żadnej z wstrzykniętych próbek oczyszczonej wody Millipore nie wykryto pików analitów ani związków znakowanych izotopami. Nic nie wskazywało na to, że doszło do jakiegokolwiek zanieczyszczenia krzyżowego w trakcie postępowania z próbką lub ekstrakcji do fazy stałej, ponieważ ekstrahowane próbki buforu fosforanowego nie zawierały żadnego z docelowych związków. Ryzyko uzyskania wyników fałszywie pozytywnych w wyniku samozanieczyszczenia zostało zatem uznane za zminimalizowane w tym badaniu.

LoQ i LOD dla diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5 zostały określone w próbkach ścieków oczyszczonych. Granice oznaczalności zostały ustalone na 5.0 pM (1.4 ng L-1) zarówno dla diazepamu-d5 jak i nordiazepamu-d5, gdzie stosunek sygnału do szumu wynosił około 10, a uzyskana precyzja wynosiła 12.7 i 15.9 RSD % (n = 3) dla odpowiednich związków (Tabela 3), tj. w ramach przewidzianej precyzji 20%. Uzyskane w niniejszej pracy wartości LOQ mieszczą się w zakresie wartości uzyskanych w innych badaniach dla diazepamu i nordiazepamu w próbkach ścieków oczyszczonych. Jednak w tamtych badaniach ekstrahowano objętość 200 mL ścieków oczyszczonych, w porównaniu z 75 mL w prezentowanej przez nas metodzie. Granice wykrywalności wynosiły 1,7 pM (0,49 ng L-1) i 2,0 pM (0,55 ng L-1) dla diazepamu-d5 i nordiazepamu-d5, odpowiednio (Tabela 3).

Jak omówiono powyżej („Stabilność diazepamu i nordiazepamu w kwaśnych i obojętnych próbkach wodnych,” Rys. 2), diazepam i nordiazepam okazały się stabilne przez 12 dni przy pH próbki 7.0 przy przechowywaniu w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C.

Kwantyfikacja diazepamu i nordiazepamu w próbkach wody środowiskowej

Opracowana metoda LC-MS/MS została zastosowana do próbek wody środowiskowej w celu oznaczenia diazepamu i nordiazepamu. Należy podkreślić, że opracowana metoda może być zastosowana do oznaczeń diazepamu i nordiazepamu w próbkach środowiskowych w warunkach kwaśnych, jeżeli przed przechowywaniem do próbek zostaną dodane idealne wzorce wewnętrzne, tj. związki znakowane izotopami związków docelowych. W tym badaniu, związki znakowane izotopami, diazepam-d5 i nordiazepam-d5, zostały użyte jako standardy wewnętrzne w celu skompensowania potencjalnej transformacji związków i innych strat, jak również zmian podczas analizy.

Próbki oczyszczonych ścieków i wód powierzchniowych były analizowane dla diazepamu i nordiazepamu. Nie stwierdzono istotnych różnic, na poziomie 5% w teście t, pomiędzy stosunkami jonowymi uzyskanymi dla roztworów wzorcowych (Tabela 1) a tymi uzyskanymi dla „naturalnie” występującego diazepamu lub nordiazepamu (P ≥ 0,07). Stężenia diazepamu i nordiazepamu określono odpowiednio na 8,5 (2,4 ng L-1) i 66 pM (18 ng L-1). W próbkach z tej samej oczyszczalni ścieków, pobranych 14 dni później, stężenia diazepamu i nordiazepamu wynosiły odpowiednio 7,5 (2,1 ng L-1) i 75 pM (20 ng L-1). Tak więc stężenia nordiazepamu były o około jeden rząd wielkości wyższe niż stężenia diazepamu. Wyniki te są zgodne z wynikami innych badań ścieków. Ponadto, w niektórych próbkach ścieków oczyszczonych, opisanych w literaturze, nordiazepam był oznaczany ilościowo, ale diazepam nie był wykrywany. W obecnym badaniu, ani diazepam ani nordiazepam nie zostały wykryte w wodach powierzchniowych pobranych z rzeki Fyris, 3 km w górę rzeki od oczyszczalni ścieków Kungsängsverket, co wskazuje na niewielką ilość antropogenicznych emisji ścieków w górę rzeki.