Wirowanie różnicowe ograniczone kinetycznie jako niedroga i łatwo dostępna alternatywa dla elucji odśrodkowej

W wielu zastosowaniach pożądane jest oddzielenie komórek docelowych od mieszanin zawierających inne komórki o podobnej gęstości, ale różnych rozmiarach (nieznacznie lub znacznie). Przykłady obejmują generowanie zsynchronizowanych hodowli komórkowych, w których izoluje się komórki na określonym etapie ich cyklu (charakteryzującym się ich wielkością) (1-2), izolację kortykotropów od innych komórek przysadki mózgowej (3) oraz sortowanie różnych subpopulacji monocytów (4). Metodą z wyboru w odniesieniu do rozdzielania populacji komórek w oparciu o różnice w szybkości sedymentacji (w szczególności gdy różnice gęstości nie są znaczące) jest proces zwany elutrowaniem odśrodkowym (5). Tutaj separandy (zwykle komórki) poddawane są działaniu dwóch sił: (i) sile odśrodkowej, która powoduje ich sedymentację z prędkością, która jest funkcją ich gęstości i rozmiaru, oraz (ii) przepływowi konwekcyjnemu w przeciwnym kierunku, który nadaje wszystkim komórkom stałą prędkość. Przepływ i/lub prędkość wirowania mogą być regulowane w celu zebrania tylko tych komórek, których prędkość sedymentacji mieści się w określonym zakresie. Chociaż proces ten był również z powodzeniem stosowany do oddzielania komórek bakteryjnych od matryc, w których są one obecne (6) (nasze zastosowanie), potrzeba specjalistycznego sprzętu stanowi przeszkodę dla wielu laboratoriów.

Pomimo, że istnieje wiele protokołów opisanych do izolacji bakterii z różnych matryc, takich jak żywność (7-8), gleba (9) i maty mikrobiologiczne (10), które wykorzystują łatwo dostępne wirówki stacjonarne do oddzielania komórek na podstawie różnych prędkości sedymentacji, zalecane protokoły często wydają się być doraźne. Na przykład, Wang et al. (8) zalecał wirowanie przy <1000×g przez nieokreślony czas w celu usunięcia zanieczyszczeń podczas izolowania bakterii z miękkiego sera, a następnie wirowanie przy 9000×g przez 3 minuty w celu zebrania bakterii. Podobnie, do izolacji bakterii z mięsa homogenizowanego, Neiderhauser et al. (7) zalecał wirowanie przy 100×g (przez nieokreślony czas) w celu usunięcia cząstek pokarmu, a następnie wirowanie przy 3000×g (ponownie, przez nieokreślony czas) w celu zebrania bakterii. W innych przypadkach, zalecane protokoły obejmują wiele rund wirowania. Na przykład, w celu wyizolowania bakterii z mat mikrobiologicznych, Bey et al. (10) zalecają nie tylko wirowanie przy 500×g przez 15 min, ale również ponowne zawieszenie osadu i powtórzenie procedury cztery razy. Podobnie, w celu wyizolowania bakterii z gleby, Bakken (9) zaleca wielokrotne (przez „określoną liczbę razy”) wirowanie homogenatu próbki przy 630-1060×g (przez nieokreślony czas), a następnie ponowne zawieszenie i rehomogenizację. Podobne metody zostały również zaproponowane do izolacji bakterii z „pozytywnego” bulionu z posiewu krwi. Aby uzyskać czyste izolaty bakterii przed określeniem ich tożsamości przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF, Stevenson et al. (11) zastosowali wieloetapową procedurę wirowania obejmującą kolejne etapy wirowania przez „1-2 minuty” każdy przy 8500, 1000, i 13,000 RPM (wartość w g nie określona) z ponownym zawieszeniem osadu w różnych buforach na każdym etapie.

Te cytowane protokoły nie są bynajmniej jedynymi przykładami protokołów wirowania ad hoc charakteryzujących się pozornie arbitralnym wyborem prędkości wirowania i/lub czasów. Ważną konsekwencją takich protokołów ad hoc jest to, że nie zapewniają one żadnej racjonalnej podstawy, dzięki której inni mogą opracować protokoły izolowania różnych komórek docelowych z innych matryc/mieszanin komórek. Na przykład, intuicyjnie oczywiste jest, że długotrwałe wirowanie spowoduje osadzenie się wszystkich cząstek, podczas gdy wirowanie przez krótki czas spowoduje osadzenie się tylko najszybszych cząstek, pozostawiając większość wolniejszych cząstek w zawiesinie. Określenie optymalnej prędkości/czasu trwania wirowania w celu wyizolowania docelowej cząstki przy jednoczesnym wyeliminowaniu innych, pozostaje jednak sztuką. Innymi słowy, obecnie zgłaszane protokoły nie zapewniają racjonalnej podstawy do modyfikacji (określania optymalnych prędkości/czasów wirowania) dla innych powiązanych celów rozdzielania/izolacji.

Materiały i metody

Teoria

Naszą proponowaną metodę rozdzielania dwóch typów cząstek, które mają podobne gęstości, ale różne prędkości sedymentacji z powodu różnic w rozmiarze, zilustrowano na rysunku 1. Na początku procesu (Rysunek 1(1)), zawiesina (bulion do hodowli krwi, w naszym przypadku) zawierająca separandy (białe krwinki lub WBC, czerwone krwinki lub RBC, płytki krwi i bakterie) jest umieszczana jako oddzielna warstwa na wierzchu przezroczystego gęstego buforu (Histopaque 1083, w naszym przypadku). Gęstość buforu jest większa niż gęstość WBC (ρ = 1,06 – 1,08 g/mL (12)) i płytek krwi (ρ = 1,05 – 1,07 g/mL (13)), ale mniejsza niż gęstość RBC (ρ = 1,1 g/mL (14)) i bakterii (ρ = 1,105 g/mL dla Escherichia coli (15)). W trakcie wirowania wszystkie cząstki są wypychane w dół, najpierw przez warstwę górną (pożywka do hodowli krwi), a następnie do gęstego buforu (Histopaque). Podczas gdy cząsteczki o gęstości większej niż gęstość buforu (RBC i bakterie) sedymentują zarówno przez bulion do hodowli krwi, jak i gęsty bufor, mniej gęste separandy (WBC i płytki krwi) są wykluczane z tego ostatniego. Proces ten jest podobny do protokołu zalecanego do oddzielania WBC i płytek krwi z krwi pełnej (16). Dla naszego celu, jednakże, sam ten proces jest niewystarczający, ponieważ podczas gdy niektóre niepożądane cząstki (WBC i płytki krwi) są oddzielane od cząstek docelowych (bakterii) na podstawie różnic gęstości, inne cząstki o podobnych gęstościach (RBC) pozostają. Aby osiągnąć nasz cel, jakim jest zebranie wszystkich komórek docelowych (bakterii) przy jednoczesnym wyeliminowaniu wszystkich pozostałych niepożądanych cząstek (RBC), proponujemy doprowadzić układ do stanu przedstawionego na rysunku 1(4) i zatrzymać tam proces wirowania. W tym stanie, wszystkie RBC, które ze względu na swój większy rozmiar, mają większą prędkość opadania, są osadzane na dnie probówki jako granulat, podczas gdy wszystkie komórki bakterii są rozproszone w gęstym buforze.

Aby osiągnąć ten pożądany stan, jednakże, musi być spełniony szereg ograniczeń. Po pierwsze, w celu zapewnienia, że wszystkie bakterie zostaną zebrane w buforze, musimy zapewnić wystarczającą ilość czasu dla bakterii, które rozpoczęły migrację od góry (Płaszczyzna A) przez warstwę bulionu do hodowli krwi (Medium 1) i do Histopaque (Medium 2). Matematycznie oznacza to, że:

gdzie, t jest czasem, przez który prowadzony jest proces wirowania, l1 jest długością kolumny załadowanego bulionu z krwią, a vb1 jest prędkością sedymentacji bakterii w tej warstwie. Ten punkt w czasie (kiedy bakterie, które zaczynają się na płaszczyźnie A właśnie przekroczyły płaszczyznę B i wchodzą do buforu) jest przedstawiony na Rysunku 1(2).

Inną istotną cechą tego stanu jest to, że bakterie i krwinki czerwone mogły do tego czasu nie utworzyć wyraźnych „pasm” w buforze. Podczas gdy RBC, które rozpoczynają się na dowolnej płaszczyźnie poziomej migrują dalej niż podobnie zlokalizowane bakterie, RBC, które rozpoczęły się na płaszczyźnie A mogły nie wyprzedzić bakterii, które rozpoczęły się na płaszczyźnie B (interfejs pomiędzy dwoma cieczami). Aby tak się stało i aby RBC i bakterie utworzyły odrębne pasma w buforze, kolumna buforowa musi być wystarczająco długa. Nie będzie możliwe utworzenie odrębnych pasm, jeżeli, na przykład, kolumna buforowa sięgałaby tylko tak głęboko, jak poziom pokazany linią przerywaną na rysunku 1(2). Matematycznie, warunek, że RBC (szybciej osiadające cząsteczki) rozpoczynające się na Płaszczyźnie A wyprzedzają bakterie (wolniej osiadające cząsteczki) rozpoczynające się na Płaszczyźnie B może być wyrażony jako:

gdzie l1 i l2 są długościami kolumn odpowiednio bulionu do hodowli krwi (Medium 1) i buforu (Medium 2); vR1 i vR2 są prędkościami sedymentacji RBC odpowiednio w bulionie i buforze; a vb2 jest prędkością sedymentacji bakterii w buforze. Powyższe równanie można przekształcić tak, aby otrzymać:

W dodatku, byłoby pożądane, aby wszystkie bakterie pierwotnie obecne w pożywce 1 zostały zebrane w pożywce 2. Oznacza to, że do czasu, gdy bakterie zaczynające się na górze (Płaszczyzna A) przekroczą granicę między dwiema fazami (Płaszczyzna B), te zaczynające się na Płaszczyźnie B nie mogą dotrzeć na dół. Matematycznie, warunek ten jest wyrażony jako:

gdzie, vb1 jest prędkością sedymentacji bakterii w ośrodku 1. Jeżeli równania (3) i (5) są spełnione, to układ osiągnie stan przedstawiony na Rysunku 1(4), w którym wszystkie krwinki czerwone osiągnęły dno probówki i utworzyły oddzielną warstwę, ale żadna z bakterii tego nie zrobiła (wszystkie znajdują się w ośrodku 2). (Wszystkie znajdują się w ośrodku 2). Stan ten występuje po raz pierwszy, gdy wszystkie krwinki czerwone (nawet te, które zaczynają się na płaszczyźnie A) osiągnęły dno probówki. Matematycznie, ta chwila w czasie (t1) może być przedstawiona jako:

Stan ten przestaje istnieć, gdy bakterie (te początkowo obecne na interfejsie, tj. na Płaszczyźnie B) zaczynają osiągać dno probówki. Czas, w którym to nastąpi (t2) jest dany przez:

Więc, aby uzyskać najlepszy możliwy rozdział, należy (i) zapewnić, że długości kolumn dwóch mediów spełniają równania (3) i (5); i (ii) że czas trwania procesu sedymentacji (t wirowanie) jest dany przez:

Kontynuowanie wirowania dłużej niż t2 spowoduje sytuację przedstawioną na Rysunku 1(5), gdzie niektóre lub wszystkie bakterie również osadzają się na dnie. Aby uzyskać czyste izolaty pożądanych gatunków, proces wirowania musi zostać zatrzymany na etapie odpowiadającym rys. 1(4), górna warstwa odrzucona, a gęsty bufor pobrany bez naruszania osadu na dnie. Jeśli jest to pożądane, cząstki docelowe mogą być odwirowane i ponownie zawieszone w innych mediach.

To „okno operacyjne” pomiędzy t1 i t2 jest przedstawione schematycznie na rysunku 2. Tutaj, odcięta pokazuje czas wirowania, podczas gdy rzędna pokazuje frakcję cząstek RBC i bakterii, które są obecne w gęstym buforze (Medium 2). W obu przypadkach, frakcja początkowo wzrasta, gdy migrują one z górnej warstwy, pozostaje stała przez pewien czas, gdy migrują jako pasmo przez gęsty bufor i w końcu maleje, gdy osiadają na dnie. Szybciej poruszające się RBC mają bardziej strome zbocze narastania/opadania, jak również krótszy okres, kiedy wszystkie z nich są obecne w gęstym buforze. Podczas „okna operacyjnego” (pole mętne), praktycznie wszystkie bakterie (∼ 100%) są obecne w buforze, ale praktycznie żadne RBC (∼ 0%) nie są obecne.

Prędkości sedymentacji RBC i bakterii (które określają wartości liczbowe ograniczeń podanych w równaniach 3,5, i 8) można przewidzieć na podstawie ich odpowiednich kształtów, rozmiarów i gęstości. Prędkość sedymentacji jest dana (17) równaniem:

gdzie, ρ i ρl są gęstościami odpowiednio cząstki i cieczy, µ jest lepkością cieczy, R jest efektywnym promieniem cząstki, a g jest przyspieszeniem spowodowanym grawitacją/wirowaniem. E. coli to bakterie w kształcie pręcików, o długości 2 mikronów i średnicy 0,5 mikrona (18). Stąd, możemy modelować je jako sferoidy, których efektywny promień sedymentacji (R) jest dany (19) przez:

gdzie a, i b są półdługościami osi głównej i mniejszej. Tak więc dla E. coli, a = 1 mikron, a b = 0,25 mikrona. W oparciu o te wartości, oczekujemy, że E. coli będzie miała prędkość sedymentacji 26.7 mikronów/sekundę przez górną ciecz i prędkość 6.56 mikronów/sekundę przez Histopaque 1083.

Z drugiej strony, ludzkie RBC są dwuwklęsłymi dyskami, o średnicy 7-8 mikronów i grubości 2 mikronów (20). Mogą więc być modelowane jako sferoidy, których efektywny promień sedymentacji jest dany (19) przez:

gdzie, a i b są połową długości osi głównej i mniejszej odpowiednio. Przyjmując wartości 4 mikronów dla a i 1 mikrona dla b, przewidujemy, że po poddaniu wirowaniu za pomocą naszego urządzenia, Eppendorf-5804, przy względnej sile odśrodkowej 400×g, RBC będą sedymentować z prędkością 500 mikronów/sekundę przez górną warstwę o gęstości ∼1.02 g/mL (zmierzona przez nas), i 101 mikronów/sekund przez Histopaque (gęstość = 1.083 g/mL).

Prędkość osiadania cząstek może być przewidywana dokładniej poprzez uwzględnienie interakcji cząstka-cząstka. Te interakcje cząstka-cząstka powstają, gdy ciecz wypierana do góry przez osiadającą cząstkę uderza w inne cząstki bezpośrednio za lub obok pierwszej, poddając te ostatnie zwiększonemu oporowi cieczy i w ten sposób zmniejszając efektywną (średnią) prędkość sedymentacji cząstek jako grupy. Zjawisko to nazywane jest „utrudnionym osiadaniem” i musi być uwzględnione, gdy ułamek objętościowy cząstek jest nieistotny. Dostępnych jest wiele pół-analitycznych lub empirycznych wyrażeń do obliczania efektywnych prędkości osiadania dla układów z utrudnionym osiadaniem (21). Jednym z takich podejść jest korelacja Richardsona-Zakiego, gdzie efektywna prędkość osiadania (v′) jest dana przez:

gdzie v jest prędkością osiadania cząstki w przypadku nieutrudnionym, a φ jest ułamkiem objętościowym cząstek. Krew jest zwykle rozcieńczana w bulionie do posiewów krwi w rozcieńczeniu 1:4 (22). Ponieważ hematokryt (ułamek objętościowy RBC we krwi) wynosi zwykle około 0,4-0,45 (23), wypadkowy ułamek objętościowy RBC w naszej próbce wynosi około 0,1. Jeśli uwzględni się to za pomocą równania 12, wówczas przewidywane prędkości osadzania RBC w pożywkach 1 i 2 wynoszą odpowiednio 307 mikronów/sekundę i 62 mikronów/sekundę. Ponadto, w momencie, gdy hodowle krwi stają się pozytywne, zawierają one ∼108 CFU (jednostek tworzących kolonie) (komórek) bakterii na 1 ml zawiesiny (24). Jednakże, ze względu na ich mały rozmiar (promień ∼ 1 mikron), ich ułamek objętościowy pozostaje mniejszy niż 0,001, a efekt „utrudnionego osiadania” może być pominięty.

Podając objętość próbki, z której chcemy wyizolować interesujący nas typ(y) komórek, schemat blokowy podany w materiałach uzupełniających (Supplementary Figure 1) może być użyty do wyboru buforu sedymentacyjnego, przewidywania prędkości sedymentacji interesujących nas komórek we wspomnianym buforze, określenia odpowiedniej objętości (długość kolumny w dostępnej probówce do wirowania), która ma być użyta, i ostatecznie obliczenia optymalnego czasu trwania wirowania (okno operacyjne) przy użyciu dostępnej(ych) wirówki(ek). Dla naszego systemu (5 ml „pozytywnego” bulionu z hodowli krwi załadowanego do 15 ml probówek wirówkowych), proces ten jest podsumowany w Tabeli 1.

Tabela 1. Teoretyczne przewidywania minimalnych długości kolumn oraz minimalnych/maksymalnych czasów pracy.

Walidacja doświadczalna

Pierw przygotowaliśmy syntetyczną „pozytywną pożywkę do hodowli krwi” poprzez rozproszenie w 8ml pożywki BACTEC Ped-Plus (Becton Dickinson, Sparks, MD), 2ml świeżej krwi (pobranej od ochotnika) i 0.1ml zawiesiny zawierającej ∼104 CFU (komórek) na mL E. coli K-12 i inkubując mieszaninę na mieszadle nutacyjnym w temperaturze 37°C przez noc (12-14 h), aby uzyskać zawiesinę zawierającą ∼109 RBC/mL i 108 CFU/mL bakterii. 1,5 mL bulionu pobierano do probówki mikrowirówki (Eppendorf, New York, USA), a komórki „usuwano” przez wirowanie. Supernatant pobierano, a masę 1 ml mierzono przy użyciu wagi (OHaus® GA-110) w celu oszacowania gęstości cieczy w bulionie.

Dodatkowo, 5 mL dodatniego bulionu z hodowli krwi umieszczano na 5 mL Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA). Wiele takich probówek umieszczano w wirówce stołowej Eppendorf-5804 i wirowano przez różną długość czasu (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min i 90 min). Po zakończeniu procesu wirowania probówkę delikatnie wyjęto, górną warstwę (wywar z hodowli krwi) wyrzucono, natomiast warstwę Histopaque zebrano bez naruszania osadu na dnie (jeśli był obecny). Stężenie bakterii w pobranym płynie oznaczano przy użyciu standardowych metod obejmujących seryjne rozcieńczenia, posiew na podłoże Tryptic Soy Agar, inkubację i liczenie kolonii (25). Stężenia RBC uzyskano badając podwielokrotną część próbki w hemocytometrze pod mikroskopem (26).

Wyniki i dyskusja

Wyniki podsumowano na rycinie 3. Linie przedstawiają teoretyczną liczbę komórek krwi lub bakterii, których obecność jest spodziewana w warstwie Histopaque (minus osad na dnie) w oparciu o nasze przewidywania teoretyczne. Symbole stałe reprezentują średnią z co najmniej trzech odczytów zaobserwowanych liczb RBC (kwadraty) i E. coli (diamenty). Słupki błędów to odchylenie standardowe.

Jak widać na rycinie 3, obserwowane zachowanie jakościowo odpowiada naszym przewidywaniom; dla obu gęstych cząstek (krwinek czerwonych i bakterii), stężenia w Histopaque początkowo rosną z czasem, następnie pozostają stałe przez pewien czas i w końcu maleją. Stwierdzono jednak, że w przypadku RBC cały proces (wzrost, stan ustalony i spadek) przebiega nieco wolniej niż przewidywano. Efekt tej nieco niższej szybkości sedymentacji, na szczęście, nie ma wpływu na nasze okno operacyjne, ponieważ początek okna jest regulowany przez czas potrzebny na wejście wszystkich bakterii do gęstego buforu. Do czasu, kiedy to nastąpi, stężenie RBC w gęstym buforze jest pomijalne. Innymi słowy, okno operacyjne przewidywane przez nasze modele (∼20 min do ∼75 min) jest widoczne, że się utrzymuje.

Większość powszechnie występujących bakterii jest również dość mała (∼1 mikron długości charakterystycznej) a ich gęstość jest podobna. (np. 1,1 g/mL dla Pseudomonas (27); 1,13 g/mL dla Streptococcus (28) i 1,135 g/mL dla Bacillus (29)). Prawdopodobnie więc ich prędkość sedymentacji będzie porównywalna z E. coli zarówno w bulionie do posiewów krwi, jak i Histopaque-1083, a co za tym idzie, okno operacyjne również powinno być podobne. Chociaż nasze okno operacyjne (∼20 min do ∼75 min) ma zastosowanie tylko dla naszego sprzętu i parametrów eksperymentalnych, nasza analiza teoretyczna dostarcza podstaw do przewidywania innych okien operacyjnych, nie tylko w celu izolacji bakterii z dodatnich bulionów do hodowli krwi przy użyciu innego sprzętu, ale także do izolacji innych komórek docelowych z różnych matryc przy użyciu gęstych buforów. Metoda ta może być również wykorzystana w sposób sekwencyjny do izolacji celu z mieszaniny zawierającej zarówno gatunki szybciej jak i wolniej osiadające. W takich przypadkach należy użyć naszej metody, aby najpierw wyeliminować wszystkie szybciej poruszające się gatunki, a następnie użyć jej do zebrania najszybciej osiadającego gatunku docelowego w pozostałej mieszaninie.

.