Wydajna biotynylacja i jednoetapowe oczyszczanie znakowanych czynników transkrypcyjnych w komórkach ssaków i myszy transgenicznych

Wyniki

Efficient Biotinylation of Tagged GATA-1 in Transfected Cells. Schemat specyficznej biotynylacji in vivo znakowanych białek w komórkach ssaków jest przedstawiony na Rys. 1A. Zgodnie z tą procedurą, mały (23 aa) znacznik peptydowy jest sprzęgany z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i współekspresjonowany w komórkach wraz z BirA, bakteryjną ligazą białkowo-biotynową (20). Stosowany znacznik peptydowy został wcześniej wyizolowany z biblioteki syntetycznych peptydów badanych pod kątem biotynowania z udziałem BirA, które zachodzi specyficznie przy reszcie lizynowej znacznika (16). Przeszukiwanie bazy danych białek nie zidentyfikowało żadnych naturalnie występujących białek, które posiadają motyw sekwencji podobny do motywu znacznika peptydowego.

Białkiem, które znakowaliśmy podczas testowania tego systemu, był niezbędny murine hematopoietic transcription factor GATA-1 (dla przeglądu, patrz ref. 25). Znacznik został połączony N-końcowo z GATA-1 i wyrażony pod kontrolą kasety ekspresyjnej ludzkiej β-globiny w komórkach MEL, które mogą być indukowane do przechodzenia terminalnego różnicowania komórek erytroidalnych (22). BirA został również sklonowany i wyrażony w komórkach MEL przy użyciu kasety ekspresyjnej ludzkiej globiny. Wyizolowano klony odpowiadające pojedynczym i podwójnym stabilnym transfekcjom dla znakowanych GATA-1 i BirA i wstępnie przebadano pod kątem ekspresji obu konstruktów. W przypadku GATA-1, analiza Western blot z użyciem przeciwciała GATA-1 wykrywa wolniej migrujące znakowane białko, jak również endogenne GATA-1 w ekstraktach jądrowych z transfekowanych komórek (Fig. 1B, paski 1 i 2). Ekspresję BirA analizowano na poziomie RNA (dane nie pokazane).

Następnie przetestowaliśmy, na wybranych stabilnych transfekantach, czy znakowane białko GATA-1 było biotynylowane przez BirA. Oznaczanie ekstraktów jądrowych z klonów komórek MEL przy użyciu koniugatu streptawidyna-HRP wykazało silny sygnał odpowiadający znakowanemu białku GATA-1, wykrywalny tylko w pasie podwójnego transfekanta znakowanego GATA-1/BirA (Fig. 1B, pas 5). Biotynowanie znakowanego GATA-1 nie jest widoczne przy braku BirA (Rys. 1B, pas 6). Wyniki te potwierdzają, że białko BirA jest syntetyzowane w aktywnej formie w transfekowanych komórkach MEL. Ponadto, bardzo mało niespecyficznego tła biotynylacji obserwuje się w ekstraktach jądrowych komórek MEL wyrażających tylko BirA (Fig. 1B, pas 7). Wnioskujemy zatem, że ekspresja bakteryjnej ligazy białkowo-biotynowej BirA w komórkach MEL może specyficznie biotynować czynnik transkrypcyjny ssaków noszący unikalny znacznik peptydowy.

Następnie sprawdziliśmy wydajność biotynilacji, wiążąc znakowany GATA-1 w surowych ekstraktach jądrowych do paramagnetycznych kulek Dynabeads ze streptawidyną (Fig. 1C). Analiza materiału eluowanego z kulek wykazała, że prawie całe znakowane białko GATA-1 zostało związane (porównaj pas 2 z pasami 1 i 3, Fig. 1C). Powtórzenie tego samego filtra ze streptawidyną-HRP wykazało ≈100% wydajność biotynowania i wychwytywania znakowanego GATA-1 przez kulki (Rys. 1C, paski 4 i 5). Ponadto, zgodnie z tym, co zaobserwowano na Figurze 1B, istnieje niewielkie tło wiązania endogennie biotynylowanych białek do kulek, jak wykryto przez streptawidynę-HRP (Figura 1C, pas 5). Dane te pokazują, że znakowany GATA-1 jest bardzo wydajnie biotynylowany i odzyskiwany z ekstraktów przez wiązanie streptawidyny, ze znikomym tłem biotynylacji.

Single-Step Purification of Biotinylated GATA-1 from Crude Nuclear Extracts by Streptavidin Binding. Zbadaliśmy również wykonalność jednoetapowego oczyszczania w izolacji biotynylowanego GATA-1 z surowych ekstraktów jądrowych poprzez bezpośrednie wiązanie do kulek streptawidyny w warunkach umiarkowanej surowości (150 mM NaCl/0.3% Nonidet P-40/200 ng/μl albuminy surowicy kurczaka). Najpierw przeprowadziliśmy próbę kontrolnego wiązania z 5 mg surowych ekstraktów jądrowych z komórek MEL wykazujących ekspresję tylko BirA (Rys. 2, pas 4). Wymywany materiał składał się z około pięciu silnie wybarwionych pasm na tle znacznie słabszych pasm (Rys. 2, pas 5). Zidentyfikowaliśmy białka wiążące się z tłem, wycinając cały pas z żelu i analizując go metodą chromatografii cieczowej-tandem MS. Zidentyfikowane w ten sposób białka zostały sklasyfikowane w Tabeli 1 według funkcji biologicznej i przedziału komórkowego, zgodnie z definicją Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org). Wyniki wykazały, że najliczniejszymi zidentyfikowanymi białkami tła były naturalnie biotynylowane karboksylazy i związane z nimi enzymy, które w dużej mierze pokrywały się z intensywnie wybarwiającymi się pasmami. Stwierdziliśmy również wiązanie w tle obfitych białek jądrowych zaangażowanych w przetwarzanie mRNA, takich jak czynniki splicingowe, jak również białek rybosomalnych. Łącznie, te trzy klasy białek stanowiły >80% wiązania tła w stosowanych warunkach (Tabela 1). Warto zauważyć, że bardzo niewiele peptydów zostało zidentyfikowanych jako odpowiadające czynnikom zaangażowanym w regulację transkrypcji (Tabela 1). Wnioskujemy, że wiązanie tła do kulek streptawidyny jest głównie spowodowane przez endogenne biotynylowane białka, jak również obfite czynniki jądrowe zaangażowane w przetwarzanie mRNA oraz syntezę i montaż rybosomów, z bardzo niewielkim niespecyficznym wiązaniem czynników zaangażowanych w regulację/aktywację transkrypcji.

Następnie spróbowaliśmy związać podobną ilość surowego ekstraktu jądrowego (5 mg) ze znakowanych podwójnych transfekantów GATA-1/BirA, w tych samych warunkach (ryc. 2, pas 2). Wzór barwienia w pasie z eluowanym materiałem (Rys. 2, pas 3) był znacząco różny od tego obserwowanego przy wiązaniu tła w pasie 5, wskazując na znaczące wzbogacenie w białka koelujące ze znakowanym GATA-1 (Rys. 2, pas 3 vs pas 5). Biotynowany GATA-1 i białka koelujące mogą rozcieńczać lub konkurować o wiązanie z białkami niespecyficznymi obserwowanymi w pasie 5. Wzbogacenie białek widoczne w pasie 3 może więc odpowiadać kopuryfikowanym białkom oddziałującym z GATA-1. W eluowanym materiale zaobserwowaliśmy również silnie wybarwione pasmo migrujące o wielkości zbliżonej do oczekiwanej dla znakowanego GATA-1 (Rys. 2, strzałka, pas 3). Obecność GATA-1 w tym paśmie potwierdziliśmy metodą wycinania z żelu i MS. Szczegółowa analiza wszystkich białek kopuryfikujących się ze znakowanym GATA-1 zostanie opublikowana w innym miejscu (P.R., F.G., i J.S., wyniki niepublikowane). Łącznie, dane te wykazują ilościową biotynylację znakowanego GATA-1 w komórkach MEL i jego wydajne oczyszczanie z surowych ekstraktów białkowych w jednoetapowej procedurze przez bezpośrednie wiązanie do kulek streptawidyny, z kilkoma pasmami wiążącymi w tle, odpowiadającymi głównie endogennie biotynylowanym białkom i łatwo identyfikowalnym obfitym białkom jądrowym/nukleolarnym.

Biotynylacja nie wpływa na właściwości GATA-1 w zakresie interakcji z białkami lub wiązania DNA. Ponieważ możliwe jest, że dodanie znacznika peptydowego i/lub biotynylacja może wpływać na właściwości znakowanego białka, sprawdziliśmy, czy biotynylowany GATA-1 może nadal ulegać interakcjom białko-białko ze znanym partnerem GATA-1, takim jak FOG-1 (26), i czy może wiązać się in vivo do znanych celów genowych GATA-1, takich jak mysi promotor globiny βmaj. Przeprowadziliśmy eksperyment pull-down biotynylowanego GATA-1 przez wiązanie ekstraktów jądrowych do kulek streptawidyny i sprawdziliśmy, czy FOG-1 również ulega kopuryfikacji. Stwierdziliśmy, że FOG-1 jest ściągany z ekstraktów wyrażających biotynylowany GATA-1, ale nie z ekstraktów wyrażających tylko BirA (Rys. 3A, pasy 2 i 4). Stwierdziliśmy również, że FOG-1 kopuryfikuje się z biotynylowanym GATA-1 za pomocą MS. Przeprowadziliśmy również eksperyment chromatynowy typu pull-down (ChIP), w którym sonikowana chromatyna z usieciowanych formaldehydem komórek MEL była inkubowana z kulkami streptawidyny, po czym następowała elucja związanego materiału i odzyskanie ściągniętego DNA. Używając primerów specyficznych dla promotora βmaj, stwierdziliśmy wzbogacenie dla tych sekwencji w DNA ściągniętym z chromatyny komórek wyrażających biotynylowane GATA-1, ale nie z komórek wyrażających BirA (Fig. 3B). Stwierdziliśmy również, że biotynylacja nie wpływa na rozkład subjądrowy normalnie obserwowany w przypadku GATA-1 (Fig. 5, który jest opublikowany jako informacja dodatkowa na stronie internetowej PNAS; ref. 27) i że biotynylowany GATA-1 wykazuje identyczny profil frakcjonowania biochemicznego jak endogenny GATA-1 w ekstraktach jądrowych komórek MEL (dane nie pokazane). Łącznie te wyniki dostarczają mocnych dowodów, że właściwości GATA-1 nie są naruszone przez znakowanie biotynilacją. Ponadto, dane te wskazują również na zastosowanie znakowania biotynylacją jako alternatywy dla przeciwciał w metodach obejmujących etap oczyszczania powinowactwa, takich jak pull-down białek lub badanie ChIP.