Wymiana H-D była mierzona pierwotnie przez ojca wymiany wodorowej Kaja Ulrika Linderstrøm-Langa przy użyciu rurek gradientu gęstości. W czasach współczesnych wymiana H-D monitorowana jest przede wszystkim metodami: spektroskopii NMR, spektrometrii mas oraz krystalografii neutronowej. Każda z tych metod ma swoje zalety i wady.
Spektroskopia NMREdit
Jądra wodoru i deuteru różnią się rażąco w swoich właściwościach magnetycznych. Dlatego możliwe jest rozróżnienie ich za pomocą spektroskopii NMR. Deuterony nie będą obserwowane w widmie 1H NMR i odwrotnie, protony nie będą obserwowane w widmie 2H NMR. Jeżeli w widmie 1H NMR próbki o wysokim stopniu deuteracji obserwuje się niewielkie sygnały, są one określane jako sygnały resztkowe. Mogą one być wykorzystane do obliczenia poziomu deuteracji w cząsteczce. Analogiczne sygnały nie są obserwowane w widmach 2H NMR z powodu niskiej czułości tej techniki w porównaniu do analizy 1H. Deuterony wykazują zazwyczaj bardzo podobne przesunięcia chemiczne do swoich analogicznych protonów. Możliwa jest również analiza za pomocą spektroskopii 13C NMR: różne wartości spinu wodoru (1/2) i deuteronu (1) powodują różne krotności rozszczepienia. Spektroskopia NMR może być użyta do określenia specyficznej dla miejsca deuteracji cząsteczek.
Inna metoda wykorzystuje widma HSQC. Zazwyczaj widma HSQC są rejestrowane w serii punktów czasowych, podczas gdy wodór jest wymieniany z deuterem. Ponieważ eksperyment HSQC jest specyficzny dla wodoru, sygnał będzie zanikał wykładniczo w miarę wymiany wodoru. Następnie możliwe jest dopasowanie funkcji wykładniczej do danych i uzyskanie stałej wymiany. Metoda ta daje informacje specyficzne dla wszystkich reszt w białku jednocześnie. Główną wadą tej metody jest to, że wymaga ona wcześniejszego przyporządkowania widma do danego białka. Może to być bardzo pracochłonne i zwykle ogranicza tę metodę do białek mniejszych niż 25 kDa. Ponieważ zapis widma HSQC trwa od kilku minut do kilku godzin, amidy, które szybko się wymieniają muszą być mierzone przy użyciu innych sekwencji impulsów.
Spektrometria masowaEdit
Spektrometria masowa z wymianą wodoru na deuter może określić ogólną zawartość deuteru w cząsteczkach, które zostały poddane wymianie H/D. Ze względu na wymagane przygotowanie próbki, zwykle uważa się, że zapewnia ona dokładny pomiar tylko niewymienialnych atomów wodoru. Może ona również obejmować wymianę H/D w fazie gazowej lub wymianę w fazie roztworu przed jonizacją. Ma kilka zalet w spektroskopii NMR w odniesieniu do analizy reakcji wymiany H-D: znacznie mniej materiału jest potrzebne, stężenie próbki może być bardzo niska (tak niskie, jak 0,1 uM), limit wielkości jest znacznie większa, a dane mogą być zwykle zbierane i interpretowane znacznie szybciej.
Jądro deuteru jest dwa razy cięższy niż jądro wodoru, ponieważ zawiera neutron, jak również proton. Tak więc cząsteczka, która zawiera trochę deuteru będzie cięższy niż jeden, który zawiera wszystkie wodoru. Gdy białko jest coraz bardziej deuterowane, jego masa cząsteczkowa odpowiednio wzrasta. Wykrywanie zmian w masie białka po deuteracji było możliwe dzięki nowoczesnej spektrometrii masowej białek, po raz pierwszy zgłoszone w 1991 roku przez Katta i Chait.
Determining site specific deuteracji poprzez spektrometrię mas jest bardziej skomplikowane niż przy użyciu spektroskopii NMR. Na przykład, lokalizacja i względna ilość wymiany deuteru wzdłuż kręgosłupa peptydowego może być określona w przybliżeniu przez poddanie białka proteolizie po wygaszeniu reakcji wymiany. Poszczególne peptydy są następnie analizowane pod kątem całkowitej deuteracji każdego fragmentu peptydu. Przy użyciu tej techniki rozdzielczość wymiany deuteru jest określana przez rozmiar peptydów powstałych podczas trawienia. Pepsyna, kwaśna proteaza, jest powszechnie stosowana do proteolizy, ponieważ podczas reakcji proteolitycznej musi być utrzymane pH hartowania. Aby zminimalizować wymianę wsteczną, proteoliza i następująca po niej analiza spektrometrii masowej muszą być wykonane tak szybko, jak to możliwe. Rozdział HPLC trawienia peptydowego jest często przeprowadzany w niskiej temperaturze tuż przed spektrometrią mas metodą elektrospray, aby zminimalizować wymianę wsteczną. Ostatnio stosuje się UPLC ze względu na jej lepsze możliwości rozdzielania.
W 1999 roku zaproponowano, że może być możliwe osiągnięcie rozdzielczości pojedynczych resztek poprzez zastosowanie fragmentacji deuterowanych peptydów wywołanej zderzeniem (CID) w połączeniu z tandemową spektrometrią mas. Wkrótce odkryto, że CID powoduje „zakłócenie” pozycji deuteru w peptydach. Jednakże fragmentacja wywołana przez MALDI in-source decay (ISD), electron capture dissociation (ECD) i electron transfer dissociation (ETD) przebiega z niewielkim lub żadnym scramblingiem w prawidłowych warunkach eksperymentalnych. Skrambling znakowania izotopowego jest spowodowany ogrzewaniem kolizyjnym przed dysocjacją jonu i podczas gdy CID powodują skrambling, ogrzewanie kolizyjne może również wystąpić podczas jonizacji i transportu jonów. Jednakże, poprzez staranną optymalizację parametrów instrumentu, które powodują ogrzewanie jonów, można zminimalizować skrambling wodoru do stopnia, który zachowuje znakowanie izotopowe w fazie roztworu, dopóki fragmentacja może być wykonana przy użyciu techniki, w której skrambling nie występuje. Ostatnio, fotodysocjacja w ultrafiolecie (UVPD) była również badana jako możliwa technika fragmentacji w celu lokalizacji deuteru w peptydach i białkach. W tym zakresie wnioski były niejednoznaczne, podczas gdy możliwe jest otrzymanie fragmentów UVPD, które nie uległy skramblingowi w pewnych warunkach, inni wykazali, że skrambling może wystąpić zarówno dla peptydów jak i białek podczas samego etapu fragmentacji UVPD. Obecna teoria konsolidująca te pozorne sprzeczności ma związek z podwójną ścieżką fragmentacji, która może powstać w wyniku napromieniowania UV peptydów i białek, tj. bezpośrednią i statystyczną dysocjacją. To znaczy, jeżeli warunki doświadczalne sprzyjają bezpośredniej dysocjacji i jon prekursora jest utrzymywany na niskich energiach wewnętrznych przed i podczas fragmentacji, poziom deuteru w powstałych fragmentach będzie odpowiadał nie rozszczepionemu prekursorowi. Jednakże warunki eksperymentalne mogą sprzyjać dysocjacji statystycznej podczas napromieniowania UV, szczególnie przy długich czasach napromieniowania i niskim ciśnieniu gazu, co prowadzi do wewnętrznej konwersji energii wzbudzenia elektronowego wnoszonej przez fotony UV. Wynikiem tego jest wibracyjne wzbudzenie napromieniowanej cząsteczki, które z kolei ulega skramblingowi.
Krystalografia neutronowaEdit
Wymiana wodór-deuter gatunków szybkozmiennych (np. grup hydroksylowych) może być mierzona z rozdzielczością atomową ilościowo przez krystalografię neutronową, a także w czasie rzeczywistym, jeśli wymiana jest prowadzona podczas eksperymentu dyfrakcyjnego.
Wiązki neutronów o wysokiej intensywności są generowane przez spallację w akceleratorach cząstek linac, takich jak Spallation Neutron Source. Neutrony dyfrakcjonują kryształy podobnie do promieniowania rentgenowskiego i mogą być wykorzystywane do określania struktury. Atomy wodoru, posiadające od jednego do zera elektronów w warunkach biologicznych, słabo rozpraszają promieniowanie rentgenowskie i w normalnych warunkach eksperymentalnych są praktycznie niewidoczne. Neutrony rozpraszają się od jąder atomowych i dlatego są zdolne do wykrywania atomów wodoru i deuteru.
Atomy wodoru są rutynowo zastępowane deuterem, który wprowadza silny i dodatni współczynnik rozpraszania. Często wystarczy zastąpić tylko rozpuszczalnik i labilne atomy wodoru w krysztale białka poprzez dyfuzję pary wodnej. W takiej strukturze zajętość wymienialnego atomu deuteru w krysztale będzie się doskonalić w zakresie 0-100%, bezpośrednio kwantyfikując wielkość wymiany.
.