Tabela 1
Ekspozycja, emisja i jasność
Jeśli planujesz używać wielu znaczników fluorescencyjnych, ważne jest, aby wybrać jeden z wyraźnymi pikami emisyjnymi – jak również pikami wzbudzenia, na które możesz celować za pomocą dostępnych laserów. Jeśli piki emisyjne nakładają się na siebie, ich rozróżnienie będzie trudne lub wręcz niemożliwe.
Zazwyczaj chcesz mieć najjaśniejszy znacznik fluorescencyjny w ramach dostępnego widma, aby uzyskać wyraźny sygnał i przezwyciężyć potencjalną fluorescencję tła. Wartości jasności są produktem współczynnika ekstynkcji białka i wydajności kwantowej. Jednakże, wynikowa liczba może być trudna do zinterpretowania, dlatego jasność znacznika fluorescencyjnego w stosunku do dobrze zdefiniowanego znacznika, takiego jak EGFP, jest powszechną alternatywną miarą.
Dojrzewanie i wybielanie
Dojrzewanie określa, jak długo zajmuje znacznikowi fluorescencyjnemu prawidłowe złożenie się, uformowanie chromoforu i rozpoczęcie fluorescencji. Dla zdarzeń wrażliwych na czas w żywych komórkach, krótki czas dojrzewania może być ważny. Na przykład, superfolder GFP (sfGFP) może złożyć się w mniej niż 10 minut, podczas gdy mOrange może zająć ponad cztery godziny.
Bielenie jest miarą fotostabilności, tzn. jak długo po wzbudzeniu chromofor traci zdolność do emitowania światła. Jeśli planujesz przeprowadzać długie eksperymenty poklatkowe, rozważ tag z wysoką fotostabilnością. T-szafir ma okres półtrwania wybielania (t½; czas, w którym początkowa szybkość emisji x fotonów/s zmniejsza się do połowy) wynoszący 25 sekund, ale EGFP jest znacznie bardziej stabilny, z t½ wybielania wynoszącym 174 sekundy.
Warunki środowiskowe
Jak większość białek, na znaczniki fluorescencyjne mają wpływ pH, temperatura i poziom tlenu. W zależności od środowiska, które planujesz wykorzystać, może być konieczne albo nieznaczne dostosowanie warunków, albo wybranie bardziej odpowiedniego znacznika.
PH może wpływać na piki wzbudzenia i emisji, a większość znaczników fluorescencyjnych jest wrażliwa na kwas: niektóre mogą nawet zmieniać intensywność fluorescencji przy zmianach pH (np. pHTomato). Wartość pKa jest dobrym wskaźnikiem wrażliwości na pH, ponieważ pokazuje pH, przy którym połowa chromoforów jest fluorescencyjna.
Dodatkowo, temperatura i poziomy tlenu wpływają na czas dojrzewania: warunki hipoksyjne mają tendencję do opóźniania czasu dojrzewania, podobnie jak temperatury poza optymalnym zakresem znaczników fluorescencyjnych (np. EGFP został zoptymalizowany do pracy w 37°C). Jednak nowsze znaczniki fluorescencyjne, takie jak UnaG, GFP wyizolowany z japońskiego węgorza słodkowodnego (Anguilla japonica), fluoryzują nawet przy niskim poziomie tlenu3.
Optymalizacja kodonów
Jako że większość znaczników fluorescencyjnych pochodzi z białek meduz lub koralowców, a nie z czegoś takiego jak komórki i tkanki ssaków, w których prawdopodobnie zostaną użyte, może istnieć międzygatunkowa różnica w stosowanych kodonach aminokwasów. Może to prowadzić do słabej ekspresji, a zatem niskiego sygnału.
Na szczęście wiele z nowszych wersji znaczników fluorescencyjnych zostało zoptymalizowanych pod względem kodonów, aby odzwierciedlić preferencje komórek ssaków. Na przykład w GFP, Jürgen Haas i współpracownicy poprawili sygnał 40-120 razy poprzez modyfikację sekwencji kodonów GFP4.
Jeśli używasz starszego plazmidu do generowania białek fuzyjnych, może on nie zawierać zmodyfikowanej sekwencji znacznika fluorescencyjnego. W związku z tym zawsze należy sprawdzić, czy sekwencja została zmodyfikowana do użycia w określonym gatunku.
Oligomeryzacja
Ważne jest ustalenie, czy znacznik jest monomerem czy dimerem (monomery są zwykle oznaczane przez „m” poprzedzające nazwę białka, np. mCherry), i czy ma to wpływ na eksperyment. Wiele z wczesnych znaczników fluorescencyjnych miało skłonność do tworzenia oligomerów, a oligomeryzacja może wpływać na biologiczną funkcję białka fuzyjnego. EGFP, na przykład, jest monomerem, który może tworzyć dimery, gdy jest stosowany w wystarczająco wysokich stężeniach, co może zniekształcać organelle subkomórkowe5 lub zakłócać eksperymenty takie jak FRET6. W zdecydowanej większości przypadków zaleca się stosowanie monomerycznych białek fuzyjnych.
Produkty GFP i mCherry
.