Identificarea, caracterizarea și verificarea proteinelor 130 și 131 ca fiind 14-3-3
Figura 1.
Figura 1. Regiuni de geluri colorate cu argint care prezintă petele proteice 130 și 131 după electroforeza bidimensională.
Panelul A prezintă lichid cefalorahidian normal, cu petele 130 și 131 absente. Panoul B prezintă lichid cefalorahidian de la un pacient cu boala Creutzfeldt-Jakob; săgețile indică petele 130 și 131. Gelurile din panourile C și D provin dintr-un extract de creier uman normal. Panourile A, B și C prezintă aceeași regiune de gel, cu puncte izoelectrice cuprinse între 4,8 și 6,0 (de la stânga la dreapta) pe axa x și dimensiuni cuprinse între 10 și 40 kd (de jos în sus) pe axa y. Caseta punctată din panoul C conturează regiunea prezentată în panoul D dintr-un gel cu un interval de pH de la 4,5 la 5,4. Săgețile din Panourile B și C indică localizarea spoturilor 130 și 131, care sunt etichetate în panoul D.
Rezultatele electroforezei bidimensionale pentru detectarea proteinelor 130 și 131 din lichidul cefalorahidian la pacienții cu boala Creutzfeldt-Jakob sunt prezentate în Figura 1A și Figura 1B. Îmbunătățirile tehnice recente au dus la creșterea rezoluției, cu șase pete în loc de cele două (corespunzătoare proteinelor 130 și 131) descrise inițial. Pentru a găsi o sursă abundentă a acestor proteine, am examinat țesutul cerebral normal pentru a determina dacă există proteine cerebrale localizate în apropierea constelației de pete corespunzătoare proteinelor 130 și 131 din lichidul cefalorahidian. Figura 1C prezintă o regiune a unui gel colorat cu argint după electroforeza bidimensională a proteinelor din creierul normal. Mai multe proteine apar în aceeași zonă ca și constelația 130-131, inclusiv două dintre ele care au aceeași sarcină și masă ca și constelația 130-131 din lichidul cefalorahidian. Identificarea celor două pete pe baza poziției lor a fost confirmată prin studii de comigration. Spotul 130 a fost purificat prin electroforeză bidimensională cu rază îngustă (interval de pH, 4,5 până la 5,4), așa cum se arată în figura 1D.
Spotul 130 a fost excizat din 10 blocuri, digerat enzimatic și microsecvențiat. Secvențele de aminoacizi au fost obținute din patru fragmente peptidice. Trei dintre aceste secvențe, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Leu-Ser-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys și Asn-Val-Val-Val-Xaa-Ala-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, se potrivesc cu secvența proteinei 14-3-3 umane, izoforma eta. A patra secvență, Tyr-Ser-Glu-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, corespundea cu cea a proteinei 14-3-3-3 bovine, izoforma gamma.
Anticorpul 14-3-3 a reacționat în mod specific cu proteinele 130 și 131 din lichidul cefalorahidian pe un imunoblot electroforetic bidimensional, dar nu a reacționat cu alte proteine din lichidul cefalorahidian, verificând astfel că proteinele 130 și 131 din lichidul cefalorahidian sunt proteinele 14-3-3.
14-3 Immunoanalizați
Figura 2.
Figura 2. Imunocolorarea anticorpului policlonal de iepure anti-14-3-3β după electroforeza pe gel de sodiu dodecil sulfat-poliacrilamidă.
Calea 1 arată lichidul cefalorahidian de la un pacient cu dovezi patologice de boală Alzheimer, benzile 2 și 3 arată lichidul cefalorahidian de la doi pacienți cu boala Creutzfeldt-Jakob, banda 4 arată lichidul cefalorahidian de la o vacă normală, banda 5 arată lichidul cefalorahidian de la o vacă cu encefalopatie transmisibilă de nurcă indusă experimental și dovezi patologice de boală spongiformă, banda 6 prezintă ser uman normal, banda 7 prezintă ser de la un pacient cu boala Creutzfeldt-Jakob, banda 8 prezintă un extract de creier uman normal ș i banda 9 prezintă proteina prionică purificată din creierul unui pacient cu boala Creutzfeldt-Jakob.
Descoperirea faptului că petele 30-kd din lichidul cefalorahidian (proteinele 130 și 131) sunt proteine 14-3-3 a dus la dezvoltarea unui imunoanaliză simplă pentru a ajuta la diagnosticarea encefalopatiei spongiforme transmisibile. După cum arată figura 2, în lichidul cefalorahidian de la pacienții cu boala Creutzfeldt-Jakob, a existat o bandă imunoreactivă 30-kd (benzile 2 și 3), în timp ce în lichidul cefalorahidian de la martorii sănătoși (datele nu sunt prezentate) sau de la un pacient cu boala Alzheimer (banda 1) nu a fost detectată o astfel de bandă. Așa cum era de așteptat, 14-3-3 a fost abundent într-un extract de creier uman normal (banda 8). proteina 14-3-3 nu a fost găsită în serul normal (banda 6); cu toate acestea, nu a fost detectată nici în serul de la pacienții cu boala Creutzfeldt-Jakob (banda 7). Proteina prionică purificată din creierul unui pacient cu boala Creutzfeldt-Jakob (banda 9) nu a reacționat încrucișat cu anticorpul 14-3-3, confirmând că 14-3-3 nu este o proteină prionică.
Tabelul 1.
Tabelul 1. Probe de lichid cefalorahidian evaluate cu imunoanalizatorul 14-3-3, în funcție de diagnostic. Tabelul 2.
Tabel 2. Sensibilitatea și specificitatea imunoanalizei 14-3-3 pentru boala Creutzfeldt-Jakob.
Șaizeci și opt din 71 de probe de lichid cefalorahidian de la pacienții cu boala Creutzfeldt-Jakob (96%) au fost pozitive pentru 14-3-3 (Tabelul 1 și Tabelul 2). Patru din 94 de probe (4 la sută) de la pacienți cu alte boli care implică demență au fost pozitive pentru 14-3-3 (Tabelul 1 și Tabelul 2) (P<0,001). Mai mult, atunci când pacienții cu demență despre care se știa că au avut infarcte acute ale creierului în decurs de o lună înainte de testare au fost excluși din analiză, doar 1 din 91 de probe (1 la sută) a fost pozitiv (P<0,001). Probele de la toți cei 10 pacienți cu demență cu infarcte multiple, dar fără accidente vasculare cerebrale în luna anterioară testării, au fost negative pentru 14-3-3. Singurul rezultat fals pozitiv dintre eșantioanele de lichid cefalorahidian de la ceilalți pacienți cu demență provenea de la un pacient cu un diagnostic clinic de boală Alzheimer care nu fusese verificat prin studii patologice.
14-3-3 a fost detectat în 18 dintre cele 66 de eșantioane de lichid cefalorahidian (27 la sută) de la pacienți cu alte boli neurologice care nu implicau demență. Cele 18 probe pozitive proveneau de la pacienți cu encefalită virală acută, accident vascular cerebral (fără demență) în decurs de o lună înainte de testare, hemoragie subarahnoidă sau sindromul Rett. Boala Creutzfeldt-Jakob nu a putut fi inclusă în mod rezonabil în diagnosticul diferențial al niciuneia dintre aceste afecțiuni.
În general, sensibilitatea imunoanalizei 14-3-3 ca marker pentru boala Creutzfeldt-Jakob a fost de 96 la sută (68 de rezultate pozitive adevărate împărțite la 71 de rezultate pozitive adevărate și fals negative; interval de încredere de 95 la sută, de la 92 la 99 la sută), iar specificitatea a fost de 88 la sută (164 de rezultate negative adevărate împărțite la 186 de rezultate negative adevărate și fals pozitive; interval de încredere de 95 la sută, de la 84 la 92 la sută). Mai important, specificitatea acestui test în rândul tuturor pacienților cu demență a fost de 96 la sută (90 de rezultate negative adevărate împărțite la 94 de rezultate negative adevărate și fals pozitive; interval de încredere de 95 la sută, de la 90 la 96 la sută), iar atunci când au fost excluși cei trei pacienți cu demență și infarct cerebral în decurs de o lună înainte de testare, specificitatea imunoanalizei a fost de 99 la sută (90 de rezultate negative adevărate împărțite la 91 de rezultate negative adevărate și fals pozitive; interval de încredere de 95 la sută, de la 97 la 100 la sută) (Tabelul 1 și Tabelul 2).
Compararea electroforezei bidimensionale și a imunoanalizei
Tabelul 3.
Tabel 3. Compararea electroforezei bidimensionale pentru proteinele 130 și 131 și a imunoanalizei 14-3-3.
Am comparat testul electroforetic bidimensional pentru proteinele 130 și 131 cu imunodozarea 14-3-3 în 50 de probe de lichid cefalorahidian (tabelul 3). Treisprezece din 15 eșantioane de la pacienți cu boala Creutzfeldt-Jakob au fost pozitive la ambele teste, iar celelalte 2 eșantioane au fost negative pentru proteinele 130 și 131, dar pozitive pentru proteina 14-3-3. Rezultatele celor două teste au fost identice în cazul probelor de la pacienții cu demențe care nu sunt asociate cu boala Creutzfeldt-Jakob sau cu alte tulburări neurologice. Deși specificitățile celor două teste sunt similare, imunodozarea 14-3-3 are o sensibilitate ușor mai mare.
Imunodozarea 14-3-3 la animale
Tabel 4.
Tabelul 4. Rezultatele imunoanalizei 14-3-3 în probele de lichid cefalorahidian de la animale.
Rezultatele studiilor la animale au fost în concordanță cu cele ale studiilor la om. Figura 2 prezintă rezultatele dozării în lichidul cefalorahidian de la o vacă normală (banda 4) și de la o vacă cu dovezi patologice de encefalopatie spongiformă transmisibilă (banda 5). După cum se arată în tabelul 4, proteina 14-3-3 a fost detectată în lichidul cefalorahidian de la șase din cele nouă bovine cu encefalopatie spongiformă transmisibilă de nurcă indusă experimental sau scrapie. O vacă cu caracteristici clinice, dar fără dovezi patologice de encefalopatie spongiformă transmisibilă, a avut, de asemenea, un test pozitiv. Nicio bovină de control nu a avut teste pozitive. Testul a fost pozitiv la cinci din șase oi cu scrapie dobândită în mod natural și a fost negativ la o oaie de control. Toți cei 15 cimpanzei infectați experimental au avut teste pozitive, în timp ce niciunul dintre cei 77 de cimpanzei de control nu a avut teste pozitive. Sensibilitatea generală a imunodozării 14-3-3 la animale a fost de 87%, iar specificitatea generală a fost de 99%.
.