Isolamento e Identificação de Voláteis
O nariz humano percebe muitos COVs como cheiros e estes odores são muitas vezes a nossa primeira indicação de que os bolores estão presentes. A caracterização química (isolamento, separação, identificação e quantificação) dos COVs, entretanto, requer métodos analíticos especializados, diferentes das abordagens usadas na química tradicional “úmida”. Os avanços tecnológicos no final do século XX e início do século XXI melhoraram a nossa capacidade de detectar voláteis com precisão, precisão e em baixas concentrações (Zhang e Li, 2010; Hung et al., 2015). Resumidamente, os métodos tradicionais envolvem destilação a vapor e extração líquido-líquido, seguidos de concentração e verificação química de compostos individuais. Alguns dos primeiros estudos sobre a natureza química dos COVs foram feitos usando extratos de cloreto de metileno que foram concentrados por destilação a vapor e analisados por cromatografia gás-líquido e espectrometria de massa (EM). Em um estudo inicial utilizando esta abordagem, os COVs de Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae e Aspergillus parasiticus foram analisados. Todas as quatro espécies fizeram 3-metilbutanol, 3-octanona, 3-octanol, 1-octen-3-ol, 1-octenol, e 2-octen-1-ol. Para A. niger, mais de 90% da mistura COV identificada consistia de 1-octen-3-ol, que é o composto odorífero que dá aos cogumelos o seu odor característico. Para A. parasiticus, 1-octen-3-ol era 35,6% do total da mistura volátil, enquanto o composto relacionado de oito carbonos, 2-octen-1-ol, que tem um odor desagradável a mofo, constituiu 34,8% (Kamiński et al., 1974).
Métodos têm desde então confiado na cromatografia gasosa – espectrometria de massa (GC-MS), que combina separação cromatográfica, identificação por espectros de massa e retenção cromatográfica, e quantificação de amostras voláteis. COVs no headspace de culturas fúngicas são geralmente coletados por materiais sólidos sorticulantes, como carvão ativado ou uma fibra. Cada método de coleta tem viés inato e pode permitir a formação de artefatos; em geral, compostos não polares são colhidos preferencialmente em vez de polares. A cromatografia gasosa também pode introduzir erros, pois às vezes é difícil separar dois compostos um do outro, resultando em sua conflação. Isto foi observado no caso do 2-metil-1-butanol e do 3-metil-1-butanol, isómeros que diferem apenas na transposição de um grupo metilo (Börjesson et al., 1992). Outras desvantagens da análise GC-MS incluem a necessidade de operadores qualificados, suas despesas relativas e o fato de não ser eficaz com COVs mais reativos (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao e Martin, 2002; Rappert e Müller, 2005).
Solid-phase microextraction (SPME) é um método popular e portátil. Os COVs são primeiro absorvidos e concentrados em uma fibra, e depois entregues ao detector onde ocorre a dessorção no próprio injetor de GC. SPME é bem adequado para a recolha de amostras ambientais que são depois transportadas de volta para o laboratório para identificação. Associado ao GC-MS, é um meio conveniente e amplamente utilizado para identificar COVs qualitativamente a partir de culturas microbianas ou de edifícios contaminados (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń e Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). SPME é frequentemente a melhor abordagem para determinar a quantidade relativa de um composto volátil alvo em uma situação exploratória, ou para processos de amostragem repetitivos. Entretanto, não é útil para a identificação de compostos novos.
Muitos métodos analíticos especializados têm sido desenvolvidos que complementam as abordagens clássicas da GC-MS e podem ser úteis para análises direcionadas. Por exemplo, a espectrometria de massa de reação de transferência de prótons (PTR-MS) é útil para a coleta de amostras rápidas e para a detecção de baixas concentrações (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Este método tem sido empregado em ciência ambiental, tecnologia alimentar e diagnóstico médico (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al, 2013).
Usando dessorção térmica (TD)- cromatografia de gás/espectroscopia de massa, o perfil metabólico volátil in vitro de Aspergillus fumigatus foi caracterizado indicando uma assinatura distintiva contendo o monoterpeno canfeno, α- e β-pineno, e o limoneno; e os compostos sesquiterpenos α- e β-trans-bergamoteno (Koo et al., 2014).
Espectrometria de fluxo de íons selecionados para a espectrometria de massa (SIFT-MS) tem a capacidade de detectar COVs microbianos com velocidade e sensibilidade em uma mistura gasosa moderadamente complexa. É capaz de visar COVs em baixas concentrações por bilhão e pode medir certos compostos na faixa de parte por trilhão. Nesta técnica, os COVs totais são ionizados dentro de um tubo de fluxo, não necessitando de separação cromatográfica (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). O método tem sido utilizado para quantificar os COVs emitidos por A. fumigatus na cocultura com bactérias que são frequentemente encontradas em pulmões humanos doentes. Culturas com A. fumigatus produziram quantidades “copiosas” de amônia e os compostos organosulfurados metanoetiol (também conhecido como metil mercaptan), sulfeto de dimetila e dissulfeto de dimetila (Chippendale et al., 2014).
Exploração por destilação simultânea (SDE) inclui uma fibra de sílica curta coberta com material orgânico como fase estacionária para concentrar COVs que são então dessorados em um injetor quente. A SDE tem sido usada para determinar componentes voláteis em análises ambientais, alimentares, forenses, petrolíferas, farmacêuticas e de polímeros a fim de obter amostras mais concentradas (Orav et al., 1996). Por exemplo, certos compostos de sabor foram estudados usando uma combinação de SDE e SPME. Os compostos de sabor podem ser analisados quantitativamente pela SDE, enquanto a SPME é usada para rastreamento simples, rápido e rotineiro (Cai et al., 2001).
Espectrômetro de mobilidade de íons de coluna multi-multicapilar (MCC-IMS) tem sensibilidade à peça por trilhão de faixa, de alta velocidade, e requer baixo conhecimento técnico. Metabolitos característicos das espécies A. fumigatus e Candida foram diferenciados na análise do espaço da cabeça por esta abordagem (Perl et al., 2011).
Nóses electrónicos (e-noses) traduzem os voláteis em sinais eléctricos baseados na interacção com superfícies electrónicas e podem ser utilizados para a detecção de compostos conhecidos. Os narizes electrónicos são compostos por um grupo de sensores químicos com diferentes selectividades, uma unidade de pré-processamento de sinais e um sistema de distinção de padrões (Gardner e Bartlett, 1994). Diferentes COVs formam uma impressão digital característica que pode ser distinguida através de comparações com padrões previamente gravados no sistema de reconhecimento. A aplicação médica dos narizes eletrônicos focou originalmente em patógenos bacterianos ou doenças não infecciosas, como câncer pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica e asma (Valera et al., 2012). Dependendo da aplicação, amostras de COV de esfregaços, expectoração, soro, fezes, respiração ou urina são utilizadas para fins diagnósticos. Amostras de respiração têm sido usadas para a detecção precoce da aspergilose (de Heer et al., 2013).
Existem ainda muitos desafios técnicos no trabalho com COVs fúngicos, e muitas vezes é difícil comparar os resultados obtidos entre diferentes laboratórios. A mesma espécie fúngica pode ter diferentes perfis de COV com base em fatores ambientais e genéticos desconhecidos ou não controlados. Além disso, o protocolo experimental utilizado pode afetar drasticamente o perfil dos COVs. Por exemplo, em trabalhos sobre Aspergillus flavus, de Lucca et al. (2010) detectaram apenas um terpeno usando SPME para coletar os voláteis antes de submetê-los a GC-MS. Mais tarde empregando um concentrador de amostras antes de submetê-los a um modelo diferente de instrumento GC-MS, o grupo foi capaz de discernir vários terpenos (de Lucca et al., 2012). O método de manuseio de materiais antes da experimentação pode resultar em artefatos e a autoclavagem pode causar a formação de voláteis nãobiogênicos (Börjesson et al., 1992). Como os dados são frequentemente inconsistentes entre os ensaios, alguns autores questionaram a reprodutibilidade das emissões microbianas de COV (Schleibinger et al., 2002). O trabalho futuro com COVs fúngicos precisa ser conhecido dos muitos fatores que podem influenciar os resultados. Seria útil se as diretrizes para melhores práticas fossem desenvolvidas pela comunidade de cientistas que estudam os COVs fúngicos.