Nadar num mar de células: Porquê genómica de células únicas?
Sistemas biológicos complexos resultam da função coordenada de células individuais executando uma intrincada “dança”, cada uma contribuindo com o seu papel especial para o conjunto. Devido a esta complexidade, a pesquisa de expressão gênica em organismos, tecidos ou populações de células é frequentemente limitada pelo uso de métodos tradicionais de RNA-seq em massa. Como cientistas, entendemos intuitivamente que quando “trituramos e encontramos” a fim de realizar experimentos em nossa mistura diluída de RNA, estamos realmente tendo apenas uma pequena idéia do que pode estar acontecendo em nossas células de interesse: diferenças de célula para célula são perdidas e a heterogeneidade celular pode ser completamente mascarada. Na verdade, a análise de expressão de RNA em massa descreve frequentemente um estado inferido no qual nenhuma (ou muito poucas) das células realmente existem!
Talvez você seja um neurocientista, trabalhando no cérebro do rato, estudando o desenvolvimento de uma subpopulação de neurônios que produzem um neurotransmissor específico. Se você pudesse isolar essa população e analisá-la célula por célula, os potenciais insights seriam, de fato, neuronalmente estimulantes! Da mesma forma, no caso da pesquisa do câncer: qual a melhor maneira de separar a expressão gênica e, talvez mais importante, a heterogeneidade celular, em um tumor? E se você pudesse comparar não só as diferenças inter-tumorais, mas também intra-tumorais e explorar as populações de células imunes relacionadas ao microambiente do tumor? Esta diversidade, muitas vezes obscurecida por métodos de RNA-seq em massa, pode ser revelada pelo uso de RNA-seq de célula única para explorar especificamente estas populações de células clinicamente significativas. Os exemplos de inconvenientes da análise a granel são abundantes, e a dissecação das diferenças do tipo celular na maioria desses complexos sistemas biológicos, se não em todos, é fundamental para nossa compreensão de suas contribuições, especialmente durante o desenvolvimento e na progressão da doença.
Como isolamos e analisamos células isoladas?
10x A tecnologia de RNA-seq monocelular da Genomics (scRNA-seq), a solução Chromium™ Single Cell 3′ Solution, permite analisar transcriptomas célula por célula através do uso de partição microfluídica para capturar células únicas e preparar bibliotecas de cDNA com código de barras, sequenciamento de próxima geração (NGS). Especificamente, células únicas, reagentes de transcrição reversa (RT), contas de gel contendo oligonucleotídeos com código de barras e óleo são combinados em um chip microfluídico para formar vesículas de reação chamadas Contas de Gel em Emulsão, ou GEMs. Os GEMs são formados em paralelo dentro dos canais microfluídicos do chip, permitindo ao usuário processar 100’s a 10.000’s de células únicas em uma única execução de 7 minutos Chromium™ Instrument run. É importante notar que as células são carregadas em uma diluição limitante para maximizar o número de GEMs contendo uma única célula para garantir uma baixa taxa de doublet, mantendo uma alta taxa de recuperação de células de até ~65%.
Cada GEM funcional contém uma única célula, uma única Conta de Gel e reagentes RT. Dentro de cada vesícula de reação GEM, uma única célula é lisada, o Gel Bead é dissolvido para liberar os oligonucleotídeos RT com código de barras idêntico em solução, e ocorre a transcrição reversa do mRNA poladenilado. Como resultado, todos os cDNAs de uma única célula terão o mesmo código de barras, permitindo que as leituras sequenciais sejam mapeadas de volta às suas células originais de origem única. A preparação das bibliotecas de NGS a partir destes cDNAs com código de barras é então realizada em uma reação em massa altamente eficiente. O vídeo abaixo dá uma ótima explicação visual de como tudo isso funciona.
From sample prep to how-to videos: Links úteis para começar
O fluxo de trabalho da Célula Única de Crómio 3′ começa com suas células de interesse seguido pela construção da biblioteca NGS usando nossos kits de reagentes e o Controlador de Crómio. A preparação de sua biblioteca de cDNA com código de barras (como geralmente descrito no vídeo acima) é um passo importante e fiel ao ditado “lixo entra, lixo sai” – preparar suspensões de células de alta qualidade é a chave para obter o máximo de saída ou seus dados de RNA-seq. Se você precisar de assistência com o processo de preparação de células, temos vários protocolos demonstrados disponíveis em nosso site, como a dissociação de tecido neural ou a preparação de suspensões proto-plásticas de musgo para uso em scRNA-seq, com mais protocolos sendo adicionados regularmente em nosso site de suporte. Para orientação e recomendações sobre como melhor preparar suas amostras uma vez em suspensão, um bom ponto de partida é nosso guia de preparação de células individuais, onde você pode aprender mais sobre as melhores práticas e ver um protocolo geral. Se você é mais um aprendiz visual, nossos how-to-videos, especialmente os Capítulos 4 a 7, devem ajudá-lo no processo de preparação da amostra e da biblioteca.
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Guia de preparação de células únicas
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Protocolos demonstrados
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Como…ao-videos
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Chromium™ Controlador
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Guias do utilizador
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Como…to-videos
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Cell Ranger™ Software
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Loupe™ Cell Browser
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How-to-videos
Analisando os seus dados, uma célula de cada vez
Após a preparação da sua biblioteca, o sequenciamento é realizado utilizando os instrumentos de sequenciamento Illumina®. Isto leva à parte divertida: colher insights biológicos de seus dados de RNA-seq de uma única célula! A (potencial) enorme quantidade de dados que você gera a partir da solução Chromium Single Cell 3′ Solution pode ser facilmente manipulada por nosso software e ferramentas de visualização que foram projetadas para tirar muitas das adivinhações da Célula Ranger™. O software transforma os dados de seqüenciamento de código de barras em arquivos prontos para análise de expressão de células únicas, e a visualização é realizada através do Navegador de Células Loupe™. Se você gostaria de um tutorial passo-a-passo sobre o uso de nosso software, os Capítulos 8 a 11 de nossos how-to-videos cobrem tudo desde a contagem de transcrições com o Software Cell Ranger até a bela visualização de dados com o Navegador de Células Loupe. Há também um número crescente de ferramentas de análise de célula única desenvolvidas pela comunidade, incluindo Seurat, Monocle e Cell View. Leia mais sobre essas ferramentas de análise e outros artigos de célula única no Blog 10x Genomics onde destacamos importantes contribuições de pesquisa, fornecemos dicas e truques, e mantemos você atualizado sobre todas as coisas de célula única!
Se você tiver qualquer outra dúvida ou preocupação sobre como começar com a Solução Chromium Single Cell 3′, sinta-se à vontade para deixar um comentário aqui ou entre em contato conosco diretamente. Seja acompanhando o desenvolvimento organóide cerebral, estudando o transplante de medula óssea em pacientes com leucemia mielóide aguda, ou desvendando um novo caminho para a auto-renovação das células-tronco intestinais, o número de publicações de monocélulas de cromo está crescendo diariamente, e estamos ansiosos para ouvir sobre todas as suas incríveis pesquisas!