18O labeling: uma ferramenta para proteómica

É apresentada uma avaliação da rotulagem proteolítica e quantificação de proteínas para fins diagnósticos usando tripsina e H2O 18O enriquecido. Demonstramos que a quantificação comparativa ou relativa pode ser realizada de forma eficaz com esta abordagem. Desenvolvemos um protocolo que permite a conservação dos peptídeos rotulados em água natural em abundância, sem medo de troca posterior, desde que o pH seja suficientemente baixo para extinguir a atividade catalítica da tripsina, mas não tão baixo a ponto de promover a troca química posterior. Como a eficiência da rotulagem depende da natureza do peptídeo, não existe uma relação linear simples entre o conteúdo relativo da mistura de 16O/18O (x) e a eficiência da rotulagem (y); ao contrário, segue uma relação baseada na probabilidade y = x(2). Como tal, a extensão da rotulagem do peptídeo usando rácios de mistura de 16O/18O digest buffer pode desviar-se significativamente daquela esperada com base numa relação linear. A avaliação da eficiência relativa do Ziptip indicou uma perda na recuperação da amostra, uma vez que a concentração do peptídeo foi reduzida em condições normais, sugerindo que existe um limite abaixo do qual há retornos decrescentes. Além disso, as perdas adsorventes devidas à secagem e recuperação Speedvac indicaram perdas modestas (20%) que podem variar muito (0-50%) de peptídeo para peptídeo. A eficiência da digestão em dissolução das misturas proteicas padrão em função da concentração revelou uma diminuição linear com diminuição da concentração. Isto é consistente com os efeitos cinéticos da enzima e enfatiza um potencial erro de quantificação que pode surgir ao avaliar a expressão diferencial com base na detecção do peptídeo. Os resultados de nossos estudos demonstram o poder da rotulagem 18O como uma ferramenta de otimização para o desenvolvimento de processos proteômicos.