Identificação, Caracterização e Verificação de Proteínas 130 e 131 como 14-3-3
Figura 1.
Figura 1. Regiões de géis coloridos com prata mostrando pontos de proteína 130 e 131 após eletroforese bidimensional.
Painel A mostra líquido cefalorraquidiano normal, com as manchas 130 e 131 ausentes. O painel B mostra líquido cefalorraquidiano de um paciente com doença de Creutzfeldt-Jakob; as setas apontam para as manchas 130 e 131. Os géis nos painéis C e D são de um extracto de cérebro humano normal. Os painéis A, B e C mostram a mesma região de gel, com pontos isoelétricos variando de 4,8 a 6,0 (da esquerda para a direita) no eixo x, e tamanhos variando de 10 a 40 kd (de baixo para cima) no eixo y. A caixa pontilhada no Painel C delineia a região mostrada no Painel D a partir de um gel com uma faixa de pH de 4,5 a 5,4. As setas nos Painéis B e C indicam a localização dos pontos 130 e 131, que são rotulados no Painel D.
Os resultados da eletroforese bidimensional para a detecção das proteínas 130 e 131 do líquido cefalorraquidiano em pacientes com doença de Creutzfeldt-Jakob são mostrados na Figura 1A e Figura 1B. Melhorias técnicas recentes resultaram em maior resolução, com seis pontos em vez dos dois (correspondentes às proteínas 130 e 131) originalmente descritos. Para encontrar uma fonte abundante dessas proteínas, examinamos tecido cerebral normal para determinar se alguma proteína cerebral está localizada perto da constelação de manchas correspondentes às proteínas 130 e 131 do líquido cefalorraquidiano. A Figura 1C mostra uma região de um gel cor de prata após eletroforese bidimensional de proteínas cerebrais normais. Várias das proteínas aparecem na mesma área que a constelação 130-131, incluindo duas que têm a mesma carga e massa que a constelação 130-131 no líquido cefalorraquidiano. A identificação das duas manchas com base na sua posição foi confirmada por estudos de comigração. O spot 130 foi purificado por eletroforese bidimensional de faixa estreita (faixa de pH, 4,5 a 5,4), como mostrado na Figura 1D.
Spot 130 foi excisado a partir de 10 bloqueios, digerido enzimaticamente e microequenciado. As sequências de aminoácidos foram obtidas a partir de quatro fragmentos de peptídeo. Três dessas sequências, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys e Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, combinaram com a sequência da proteína humana 14-3-3, isoforma eta. A quarta sequência, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, correspondia à proteína bovina 14-3-3, isoforma gama.
O anticorpo 14-3-3 reagiu especificamente com as proteínas 130 e 131 do líquido cefalorraquidiano num immunoblot bidimensional electroforético mas não reagiu com outras proteínas do líquido cefalorraquidiano, verificando assim que as proteínas 130 e 131 do líquido cefalorraquidiano são proteínas 14-3-3.
14-3-3 Imunoensaio
Figura 2.
Figure 2. Imuno Coloração para Anti-14-3-3β Anticorpo Policlonal do Coelho após Electroforese de Dodecyl Sulfato de Sódio-Poliacrilamida – Gel.
A faixa 1 mostra líquido cefalorraquidiano de um paciente com evidência patológica da doença de Alzheimer, as faixas 2 e 3 mostram líquido cefalorraquidiano de dois pacientes com doença de Creutzfeldt-Jakob, a faixa 4 mostra líquido cefalorraquidiano de uma vaca normal, a faixa 5 mostra líquido cefalorraquidiano de uma vaca com encefalopatia vison transmissível induzida experimentalmente e evidência patológica de doença espongiforme, A pista 6 mostra soro humano normal, a pista 7 mostra soro de um paciente com doença de Creutzfeldt-Jakob, a pista 8 mostra um extrato de cérebro humano normal e a pista 9 mostra proteína prion purificada do cérebro de um paciente com doença de Creutzfeldt-Jakob.
A descoberta de que as manchas do líquido cefalorraquidiano 30-kd (proteínas 130 e 131) são 14-3-3 proteínas levou ao desenvolvimento de um imunoensaio simples para auxiliar no diagnóstico da encefalopatia espongiforme transmissível. Como mostra a Figura 2, no líquido cefalorraquidiano de pacientes com doença de Creutzfeldt-Jakob, houve uma banda imunoreativa de 30-kd (faixas 2 e 3), enquanto que nenhuma dessas faixas foi detectada no líquido cefalorraquidiano de controles saudáveis (dados não mostrados) ou de um paciente com doença de Alzheimer (faixa 1). Como esperado, o 14-3-3 era abundante em um extrato de cérebro humano normal (pista 8). a proteína 14-3-3 não foi encontrada no soro normal (pista 6); entretanto, também não foi detectada no soro de pacientes com doença de Creutzfeldt-Jakob (pista 7). A proteína priónica purificada do cérebro de um doente com doença de Creutzfeldt-Jakob (via 9) não teve uma reacção cruzada com o anticorpo 14-3-3, confirmando que 14-3-3 não é proteína priónica.
Tabela 1.
Tabela 1. Amostras de Fluido Cerebrospinal Avaliadas com o Imunoensaio 14-3-3, de acordo com o Diagnóstico. Tabela 2.
Tabela 2. Sensibilidade e Especificidade do Imunoensaio 14-3-3 para a Doença de Creutzfeldt-Jakob.
Sixtenta e oito de 71 amostras de líquido cefalorraquidiano de doentes com a doença de Creutzfeldt-Jakob (96%) foram positivas para 14-3-3 (Tabela 1 e Tabela 2). Quatro de 94 amostras (4%) de pacientes com outras doenças envolvendo demência foram positivas para 14-3-3 (Tabela 1 e Tabela 2) (P<0,001). Além disso, quando pacientes com demência conhecidos por terem tido infarto agudo do cérebro dentro de um mês antes do teste foram excluídos da análise, apenas 1 de 91 amostras (1%) foi positiva (P<0,001). As amostras de todos os 10 pacientes com demência multi-infarto, mas sem AVC no mês anterior ao teste, foram negativas para 14-3-3. O resultado falso positivo único entre as amostras de líquido cefalorraquidiano dos outros pacientes com demência foi de um paciente com diagnóstico clínico de doença de Alzheimer que não havia sido verificado por estudos patológicos.
14-3-3 foi detectado em 18 das 66 amostras de líquido cefalorraquidiano (27%) de pacientes com outras doenças neurológicas que não envolviam demência. As 18 amostras positivas foram de pacientes com encefalite viral aguda, acidente vascular cerebral (sem demência) dentro de um mês antes do teste, hemorragia subaracnoidea ou síndrome de Rett. A doença de Creutzfeldt-Jakob não pôde ser razoavelmente incluída no diagnóstico diferencial de nenhuma dessas doenças.
Overall, a sensibilidade do imunoensaio 14-3-3 como marcador da doença de Creutzfeldt-Jakob foi de 96% (68 resultados verdadeiros positivos divididos por 71 resultados verdadeiros positivos e falsos negativos; intervalo de confiança de 95%, 92 a 99%), e a especificidade foi de 88% (164 resultados verdadeiros negativos divididos por 186 resultados verdadeiros negativos e falsos positivos; intervalo de confiança de 95%, 84 a 92%). Mais importante, a especificidade deste ensaio entre todos os pacientes com demência foi de 96 por cento (90 resultados verdadeiros negativos divididos por 94 resultados verdadeiros negativos e falsos positivos; intervalo de confiança de 95 por cento, 90 a 96 por cento), e quando os três pacientes com demência e enfarte cerebral no mês anterior ao teste foram excluídos, a especificidade do imunoensaio foi de 99 por cento (90 resultados verdadeiros negativos divididos por 91 resultados verdadeiros negativos e falsos positivos; intervalo de confiança de 95 por cento, 97 a 100 por cento) (Quadro 1 e Quadro 2).
Comparação de Electroforese Bidimensional e Imunoensaio
Tabela 3.
Tabela 3. Comparação da Electroforese Bidimensional para Proteínas 130 e 131 e do Imunoensaio 14-3-3.
Comparamos o ensaio electroforético bidimensional para as proteínas 130 e 131 com o imunoensaio 14-3-3 em 50 amostras de líquido cefalorraquidiano (Tabela 3). Treze de 15 amostras de doentes com doença de Creutzfeldt-Jakob foram positivas em ambos os testes e as outras duas amostras foram negativas para as proteínas 130 e 131 mas positivas para a proteína 14-3-3. Os resultados dos dois testes foram os mesmos em amostras de pacientes com demências não associadas à doença de Creutzfeldt-Jakob ou outras doenças neurológicas. Embora as especificidades dos dois testes sejam semelhantes, o imunoensaio 14-3-3 tem uma sensibilidade ligeiramente superior.
14-3-3 Immunoassay in Animals
Tabela 4.
Tabela 4. Resultados do Imunoensaio 14-3-3 em Amostras de Líquido Cerebrospinal de Animais.
Os resultados dos estudos em animais foram consistentes com os dos estudos em humanos. A figura 2 mostra os resultados do ensaio em fluido cerebrospinal de uma vaca normal (pista 4) e de uma vaca com evidência patológica de encefalopatia espongiforme transmissível (pista 5). Como mostra a Tabela 4, foi detectada proteína 14-3-3 no líquido cefalorraquidiano em seis dos nove bovinos com encefalopatia espongiforme transmissível induzida experimentalmente ou tremor epizoótico. A única vaca com características clínicas mas sem evidência patológica de encefalopatia espongiforme transmissível também teve um teste positivo. Nenhum gado de controle teve testes positivos. O teste foi positivo em cinco das seis ovelhas com tremor epizoótico naturalmente adquirido e foi negativo em uma ovelha-controle. Todos os 15 chimpanzés infectados experimentalmente tiveram testes positivos, enquanto que nenhum dos 77 chimpanzés-controle teve. A sensibilidade geral do imunoensaio 14-3-3 em animais foi de 87%, e a especificidade geral foi de 99%.