H-D foi medida originalmente pelo pai da troca de hidrogénio Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang usando tubos de gradiente de densidade. Nos tempos modernos, a troca H-D tem sido monitorada principalmente pelos métodos: espectroscopia NMR, espectrometria de massa e cristalografia de neutrões. Cada um destes métodos tem suas vantagens e desvantagens.
Espectroscopia NMREditar
Núcleos de deutério e hidrogênio são grosseiramente diferentes em suas propriedades magnéticas. Assim, é possível distingui-los pela espectroscopia NMR. Deuterons não serão observados em um espectro de 1H NMR e, inversamente, prótons não serão observados em um espectro de 2H NMR. Quando são observados pequenos sinais num espectro de 1H NMR de uma amostra altamente deuterada, estes são referidos como sinais residuais. Eles podem ser usados para calcular o nível de deuteração em uma molécula. Sinais analógicos não são observados em espectros de RMN de 2H devido à baixa sensibilidade desta técnica em comparação com a análise de 1H. Os Deuterons normalmente exibem mudanças químicas muito semelhantes aos seus prótons análogos. A análise através da espectroscopia 13C NMR também é possível: os diferentes valores de spin de hidrogênio (1/2) e deutério (1) dão origem a diferentes multiplicidades de splitting. A espectroscopia NMR pode ser usada para determinar a deuteração de moléculas específicas do local.
Outro método usa espectros de HSQC. Tipicamente os espectros HSQC são registrados em uma série de timepoints enquanto o hidrogênio está trocando com o deutério. Como o experimento HSQC é específico para hidrogênio, o sinal irá decair exponencialmente à medida que o hidrogênio for trocando. É então possível ajustar uma função exponencial aos dados, e obter a constante de troca. Este método fornece informação específica de resíduos para todos os resíduos da proteína simultaneamente. O maior inconveniente é que requer uma atribuição prévia do espectro para a proteína em questão. Isto pode ser muito trabalhoso e normalmente limita o método a proteínas menores que 25 kDa. Como leva minutos a horas para registrar um espectro HSQC, a troca deve ser medida rapidamente usando outras seqüências de pulso.
Espectrometria de massaEditar
Espectrometria de massa de troca de de deutério pode determinar o conteúdo total de deutério das moléculas que foram submetidas à troca H/D. Devido ao preparo da amostra necessária, normalmente é considerado para fornecer uma medição precisa apenas de átomos de hidrogênio não intercambiáveis. Também pode envolver troca de H/D na fase gasosa ou na fase de solução antes da ionização. Tem várias vantagens na espectroscopia NMR em relação à análise das reações de troca H/D: muito menos material é necessário, a concentração da amostra pode ser muito baixa (tão baixa quanto 0,1 uM), o limite de tamanho é muito maior, e os dados podem ser coletados e interpretados muito mais rapidamente.
O núcleo de deutério é duas vezes mais pesado que o núcleo de hidrogênio, pois contém um nêutron, bem como um próton. Assim, uma molécula que contenha algum deutério será mais pesada do que uma que contenha todo o hidrogênio. Como uma proteína é cada vez mais deuterada, a massa molecular aumenta de forma correspondente. A detecção da alteração da massa de uma proteína na deuteração foi possível pela moderna espectrometria de massa proteica, relatada pela primeira vez em 1991 por Katta e Chait.
Determinar a deuteração específica do local através da espectrometria de massa é mais complicado do que usar a espectroscopia NMR. Por exemplo, a localização e quantidade relativa da troca de deutério ao longo da espinha dorsal do peptídeo pode ser determinada aproximadamente submetendo a proteína à proteólise após a reação de troca ter sido extinta. Os peptídeos individuais são então analisados para a deuteração geral de cada fragmento de peptídeo. Usando esta técnica a resolução da troca de deutério é determinada pelo tamanho dos peptídeos produzidos durante a digestão. A pepsina, uma protease ácida, é comumente usada para proteólise, pois o pH de têmpera deve ser mantido durante a reação proteolítica. Para minimizar a troca inversa, a proteólise e subsequente análise de espectrometria de massa deve ser feita o mais rapidamente possível. A separação por HPLC do digestor péptico é frequentemente realizada a baixa temperatura imediatamente antes da espectrometria de massa por electrospray, para minimizar a troca de massa. Mais recentemente, a UPLC tem sido usada devido à sua capacidade superior de separação.
Foi proposto em 1999 que poderia ser possível alcançar resolução de um único resíduo usando a dissociação induzida por colisão (CID) fragmentação de peptídeos deuterados em conjunto com a espectrometria de massa tandem. Logo se descobriu que a CID causa “embaralhamento” da posição do deutério dentro dos peptídeos. Entretanto, a fragmentação produzida pelo MALDI in-source decay (ISD), a dissociação de captura de elétrons (ECD) e a dissociação de transferência de elétrons (ETD) procedem com pouco ou nenhum embaralhamento sob as condições experimentais corretas. A codificação da marcação isotópica é causada pelo aquecimento por colisão antes da dissociação do íon e enquanto o CID causa a codificação, o aquecimento por colisão também pode ocorrer durante a ionização e o transporte do íon. Entretanto, através da otimização cuidadosa dos parâmetros do instrumento que causam o aquecimento do íon, o embaralhamento por hidrogênio pode ser minimizado a um grau que preserva a rotulagem isotópica da fase de solução até que a fragmentação possa ser realizada utilizando uma técnica onde o embaralhamento não ocorra. Mais recentemente, a fotodissociação ultravioleta (UVPD) também tem sido investigada como uma possível técnica de fragmentação para localizar deutério dentro de peptídeos e proteínas. A este respeito, as conclusões foram misturadas, enquanto é possível obter fragmentos de UVPD que não foram submetidos à fragmentação sob certas condições, outras demonstraram que a fragmentação pode ocorrer tanto para os peptídeos como para as proteínas durante a própria etapa de fragmentação da UVPD. A teoria atual que consolida essas aparentes contradições tem a ver com a dupla via de fragmentação que pode surgir da irradiação UV dos peptídeos e proteínas, ou seja, a dissociação direta e estatística. Ou seja, se as condições experimentais favorecerem a dissociação direta e o íon precursor for mantido em baixas energias internas antes e durante a fragmentação, o nível de deutério dos fragmentos resultantes corresponderá ao do precursor não fragmentado. Entretanto, as condições experimentais podem favorecer a dissociação estatística durante a irradiação UV, especialmente em longos períodos de irradiação e baixa pressão de gás, levando à conversão interna da energia de excitação eletrônica contribuída pelos fótons UV. O resultado é a excitação vibracional da molécula irradiada que, por sua vez, passa por uma mistura.
Cristalografia de neutrõesEditar
A troca hidrogénio-deutério de espécies de troca rápida (por exemplo, grupos hidroxilos) pode ser medida quantitativamente pela resolução atómica por cristalografia de neutrões, e em tempo real se a troca for conduzida durante a experiência de difracção.
Feixes de neutrões de alta intensidade são geralmente gerados por spallation em aceleradores de partículas linac como a Fonte de Neutrões Spallation. Os cristais difratores de neutrões são semelhantes aos raios X e podem ser usados para determinação estrutural. Os átomos de hidrogênio, com entre um e zero elétrons em um ambiente biológico, difratam mal os raios X e são efetivamente invisíveis sob condições experimentais normais. Os átomos de hidrogênio são rotineiramente substituídos por deutério, o que introduz um fator de dispersão forte e positivo. Muitas vezes é suficiente substituir apenas os átomos de hidrogênio solvente e lábil em um cristal de proteína por difusão de vapor. Em tal estrutura, a ocupação de um átomo de deutério permutável em um cristal irá refinar de 0-100%, quantificando diretamente a quantidade de troca.