Análise e quantificação da fusão in vitro de miooblastos utilizando a Mancha Múltipla LADD

Os tecidos musculares esqueléticos adultos contêm uma população de células precursoras, conhecidas como células satélite, que são responsáveis pela reparação do músculo esquelético (1-3). As células satélites ativadas (miooblastos) migram para o local do trauma muscular, onde proliferam, diferenciam-se e se fundem em miotubos multinucleados (3-5). O sucesso final deste processo é medido pelo grau de fusão dos mioplastos residentes durante a diferenciação terminal.

Para avaliar experimentalmente a fusão mioplástica in vitro, um índice de fusão é calculado com base na detecção de imunofluorescência por microscopia. Anticorpos fluorescentes são usados para detectar proteínas estruturais das fibras musculares como a cadeia pesada de miosina (MyHC) e desmin, ou, alternativamente, a falloidina fluorescentemente rotulada pode ser usada para visualizar a F-actin (6-9). Os núcleos são rotulados fluorescentemente usando um composto de ligação de DNA, como Hoechst 33258. Subsequentemente, é calculada a percentagem de núcleos em miócitos com núcleos ≤3 (9) ou a percentagem de núcleos em miotubos MyHC-positivos (10). Essas abordagens são bem estabelecidas; entretanto, elas requerem uma otimização extensa e demorada para gerar um sinal forte e específico para o antígeno de interesse e posterior análise de fusão. Se forem utilizados anticorpos marcados fluorescentemente, o acesso a um microscópio de fluorescência é um requisito adicional não disponível em todas as instituições. A quantificação subsequente requer uma análise trabalhosa e demorada de numerosos campos de visão, a fim de obter um índice de fusão representativo da população. Estas limitações, juntamente com os custos relativos dos ensaios baseados em anticorpos, levaram-nos a desenvolver um ensaio in vitro rápido e económico para quantificação da fusão miooblástica utilizando a amplamente disponível Mancha Múltipla LADD.

A Mancha Múltipla LADD (11) é uma coloração combinada nuclear e citoplasmática que contém fucsina e azul toluidina (Cat. #70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Para nossos estudos, LADD fresco está preparado para conter 0,365 g de toluidina azul (Cat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e 0,135 g de fuchsin (Cat. #47860-25G; Sigma- Aldrich) em um volume final de 50 ml de etanol a 30%. A solução é misturada até dissolver e depois filtrada através do papel de filtro Whatman (número 4) (Cat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). A coloração LADD pode ser armazenada num recipiente de plástico ou vidro à temperatura ambiente e pode ser reutilizada. As células a serem coradas são lavadas com tampão fosfato salino (PBS) e fixadas em etanol a 70% durante 10 minutos. O etanol é removido e 500 µL de coloração LADD é adicionado, garantindo a cobertura total das células. As células são incubadas durante 1 min, após o que a coloração é removida, e as células são lavadas repetidamente com água destilada até que o LADD deixe de lixiviar para a água. As células são então deixadas a secar e armazenadas à temperatura ambiente até serem visualizadas usando microscopia de luz de contraste de fase. Para melhorar a iluminação durante a visualização, as células coradas podem ser imersas em PBS.

Para determinar se esta coloração pode ser utilizada com sucesso para visualizar a fusão do myoblast, as células C2C12 foram cultivadas até 80% de confluência (Figura 1A) sob condições de cultura padrão (12). O meio foi então alterado para meios de diferenciação contendo 2% de soro de cavalo, resultando na fusão em miotrubos (Figura 1B). O sucesso da diferenciação foi confirmado pela expressão aumentada do MyHC (Figura 1D) em comparação com as células indiferenciadas (Figura 1C). Após a coloração LADD, os mioblastos indiferenciados C2C12 apresentam um citoplasma roxo claro e um núcleo mais escuro (Figura 1E; seta). Entretanto, após a diferenciação, o citoplasma do miotubo aparece roxo escuro (Figura 1F; setas), enquanto os núcleos mais claros são claramente visíveis dentro da célula multinucleada (Figura 1F; seta). Portanto, seguindo a Mancha Múltipla LADD, núcleos claramente definidos são observados e são tão facilmente distinguíveis do citoplasma do miotubo multinucleado (Figura 1F) como vistos usando microscopia de fluorescência seguindo imunocitoquímica (Figura 1D).

Para determinar se a análise da imagem poderia ser usada para medir o progresso da fusão de miooblastos, as células C2C12 foram diferenciadas por 6 dias, e as imagens de células coloridas por LADD foram tiradas com uma ampliação de 200× usando um microscópio de luz invertida Olympus CKX41 (Olympus Corporation, Tóquio, Japão). Como esperado, o número de miócitos de fusão e miotubos aumentou claramente a cada dia de diferenciação subsequente (Figura 2A). Um índice de fusão foi então calculado, e os mioplastos de diferenciação foram vistos a aumentar incrementalmente seu índice de fusão de 0,45% (Dia 1) para 31,4% (Dia 6) (Figura 2B). O índice de fusão derivado desta forma se compara favoravelmente ao índice calculado usando imunocitoquímica padrão (para detectar MyHC) e coloração nuclear (13). Para determinar se o software de análise ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) poderia ser adaptado para quantificar a área de miofibra (como medida de fusão), uma macro foi desenvolvida e testada nas imagens representadas pela Figura 2A. A macro é configurada da seguinte forma e depois salva:

• Abrir ImageJ e clicar em “Plugins = > Macros = > Macros de Inicialização”

• Substituir o texto existente com a codificação apresentada na Tabela Suplementar S1.

As imagens são abertas no ImageJ, e a macro é executada clicando em “Macros = > Executar Macro”. Isto irá analisar as imagens uma de cada vez. O usuário deve confirmar que o limite foi configurado corretamente; apenas a área de miofibra deve ser analisada. O limite de cor pode ser alterado editando a linha de macro “setThreshold(0,130)”; aumentando o segundo número, áreas mais levemente manchadas serão incluídas, enquanto mais áreas são excluídas quando este número é reduzido. Usando este método, a área de miofibra atingiu 29,6% no 6º dia (Figura 2C), comparando bem com o índice de fusão calculado para o mesmo ponto temporal (Figura 2B). Os corantes Jenner e Giemsa também podem ser usados para colorir miotrubos para microscopia de luz da mesma forma que a LADD, porém a coloração com LADD é muitas vezes mais rápida, e a macro ImageJ que desenvolvemos permite maior controle sobre quais áreas são medidas (14).

Para validar ainda mais o uso da coloração múltipla com LADD para análise de fusão, as células C2C12 foram diferenciadas por 5 dias na presença ou ausência de 10 µM BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) e posteriormente fixadas e coradas com LADD como descrito anteriormente. BB94 é um inibidor de metaloprotease de matriz sintética disponível comercialmente que demonstrou anteriormente reduzir a fusão miooblasto (15,16). Na presença do BB94, o índice de fusão diminuiu significativamente de 50% (controle de DMSO) para 22% (P < 0,05) (Figura 2D); a análise da área de miofibra revelou a mesma tendência, com a fusão reduzida de 46% (controle de DMSO) para 21% (P < 0.05) na presença de BB94 (Figura 2E).

Aqui, apresentamos um método rápido e novo para coloração tanto da estrutura de miofibra quanto dos mionúcleos associados, utilizando a Mancha Múltipla LADD. O ImageJ é posteriormente utilizado para avaliar com precisão a área de fibra muscular como uma medida de fusão. O custo relativamente baixo do LADD e o tempo muito reduzido necessário para processamento e análise significa que a fusão pode agora ser rapidamente analisada em um laboratório padrão sem a necessidade de microscopia de imunocitoquímica e fluorescência.