Análise de co-imunoprecipitação em tempo real de co-IP monomolécula
Primeiro mostramos que a cinética da interação proteína-proteína pode ser medida em extratos celulares no nível monomolécula (Fig. 1). Como modelo de interação em um caminho de sinalização celular, escolhemos a interação entre Ras e Raf, que é o passo inicial do caminho MAPK conservado que é hiper-ativado em muitos cancros humanos5,6,7. Utilizamos o domínio Ras-binding do cRaf (cRafRBD) e uma versão de HRas contendo uma mutação de ponto único, Q61L, o que o torna constitutivamente ativo6,8,9,10,11,12. A imagem de células vivas de células HeLa co-expressoras destas duas proteínas mostrou um alto nível de co-localização (Fig. 1a e Suplemento Fig. S2). Conseguimos direcionar essa co-localização com a translocação acionada por rapamicina da FCas para a membrana plasmática13, o que resultou na localização simultânea da cRafRBD para os mesmos pontos. O co-IP convencional também produziu uma banda ocidental clara, indicando uma interação proteína-proteína seletiva entre a HRas constitutivamente ativa e a cRafRBD (Fig. 1b, esquerda). No entanto, descobrimos que esta banda proteica aparentemente clara continha apenas menos de 5% de todas as proteínas de presa, sugerindo que as proteínas de presa podem não estar estavelmente ligadas a iscas, mas removidas para a porção de fluxo através de processos de lavagem (Fig. 1b, direita e Suplementar Fig. S3). Observamos ainda que ambas as abordagens de imagem de células vivas e co-IP não podem dissecar a cinética real desta interação talvez fraca e transitória proteína-proteína.
(a) Estudo de co-localização de células vivas para a interação HRas-cRafRBD. As interações proteína-proteína entre a FCas e cRafRBD foram avaliadas observando-se a translocação da cRafRBD para a membrana plasmática junto com a FCas. CA e DN denotam as formas constitutivamente ativas e negativas dominantes da FCas, respectivamente. Barra de escalas, 10 μm. (b) Dados convencionais de co-IP para a interação HRas-cRafRBD. Para as análises de co-IP, foram utilizadas as proteínas GST-cRafRBD (esquerda) e mCherry-HRas (direita), respectivamente, como iscas imobilizadas em esferas. (c) Esquema do co-IP monomolécula em tempo real. (d) Imagem TIRF da mCherry-HRas imobilizada na superfície. Barra de escalas, 10 μm. (e) Quadros sucessivos da imagem em tempo real de co-IP monomolécula em tempo real. O traço em tempo real destes eventos de ligação é mostrado em f e marcado com um quadrado vermelho. Barra de escalas, 1 μm. (f,g) Traços exemplares em tempo real da imagem em tempo real de co-IP monomolécula. O sinal consiste principalmente de uma fluorescência de fundo difusa sobreposta com uma sequência de picos de fluorescência. (h) Um experimento de controle negativo com DN HRas (S17N) imobilizado de superfície. (i) Distribuição kbind para o experimento em f. As taxas cinéticas relevantes foram determinadas usando um ajuste de curva única exponencial (linhas sólidas). (j) Um segundo experimento de controle negativo com FLAG-eGFP de superfície imobilizada. (k) Distribuição de kdiss para o experimento em f. E kblinking para o experimento em j. Taxas cinéticas relevantes foram determinadas usando um ajuste de curva mono-exponencial (linhas sólidas). Barras de erro denotam erro padrão (s.e.; n>200).
Para visualizar a interação HRas-cRafRBD em tempo real no nível de monomolécula, fundimos o gene HRas com a proteína fluorescente vermelha mCherry e fundimos cRafRBD com a proteína fluorescente verde realçada (eGFP; Fig. 1c). Nós expressamos cada proteína em um grupo separado de células HEK293. Utilizamos a estratégia de extração de uma única molécula para imobilizar mCherry-HRas na superfície2,3 (Fig. 1c). Em seguida injetamos o segundo lisado de células inteiras contendo eGFP-cRafRBD sobre a superfície imobilizada mCherry-HRas como em um co-IP convencional (Fig. 1c). Utilizamos um microscópio de reflexão interna total (TIR) para gerar um campo elétrico evanescente que excitava seletivamente os eGFP-cRafRBDs que chegavam a 100 nm da superfície. Para observar interações proteína-proteína fracas, as chegadas de eGFP-cRafRBD únicas à superfície foram monitoradas em tempo real com o segundo lisado de células inteiras mantido na câmara (Fig. 1c).
Figure 1f mostra um traço típico em tempo real deste preparo de co-IP monomolécula. Cada traço foi produzido pela integração do sinal de fluorescência sobre uma região circular de interesse (ROI) com uma área de 1,1 μm2 (Fig. 1e). Controlamos a densidade superficial de mCherry-HRas para manter uma média de 0,5 HRas molécula por ROI (Suplemento Fig. S4). Também usamos filtragem Gaussiana durante a integração do sinal e um limiar rigoroso para a detecção do sinal para assegurar que os traços em tempo real relatassem os eventos de ligação das proteínas mono-HRas (Fig. 1g e Suplemento Fig. S5). Cada traço em tempo real consiste claramente de duas partes: uma fluorescência de fundo e picos de fluorescência individuais. Cada molécula eGFP-cRafRBD, movendo-se de acordo com o movimento Brownian, deve gastar menos de 50 μs por visita à camada de excitação TIR. Como 50 μs é três ordens de magnitude menor que a resolução de tempo do nosso aparelho de imagem (50 ms), o movimento Browniano de muitas moléculas eGFP-cRafRBD produzem um nível constante de fluorescência de fundo. Os picos de fluorescência individuais, por outro lado, indicam que um único eGFP-cRafRBD interagiu com uma molécula na superfície por tempo suficiente para sobreviver à integração do sinal de 50 ms.
A seguir analisamos a cinética essencial desta interação proteína-proteína analisando τoff, o tempo entre eventos de ligação, e τon, a duração de um único evento de ligação (Fig. 1g). Ajustando equações exponenciais únicas às distribuições τoff e τon, obtemos as taxas cinéticas de kbind e kdiss, respectivamente. Para assegurar que os picos de fluorescência são de facto o resultado de uma interacção específica HRas-cRafRBD, realizámos a mesma experiência de ligação eGFP-cRafRBD com HRas negativas de superfícieimobilizada dominante (S17N), que tem uma afinidade reduzida com GTP14,15. Com a forma negativa dominante, a freqüência de pico de fluorescência (kbind) foi seriamente diminuída (Fig. 1h). Este controle negativo prova que os picos de fluorescência não são artefatos de simples adsorção superficial de eGFP-cRafRBD nem são devidos à imobilização superficial de outras proteínas com interações espúrias de eGFP-cRafRBD. Em vez disso, estes picos de fluorescência traçam fielmente os eventos de ligação HRas-cRafRBD.
É também notável que a duração de um único evento de ligação tipicamente dura apenas algumas centenas de ms (Fig. 1f). Estudamos a dinâmica de intermitência da FLAG-eGFP16 imobilizada a uma superfície com um anticorpo anti-FLAG (Fig. 1j). O foto piscar da FLAG-eGFP ocorre em média a cada poucos segundos, dando uma taxa cinética menor que 0,3 s-1, e esta taxa de foto piscar da FLAG-eGFP é uma ordem de magnitude mais lenta que o beijo que medimos (Fig. 1k). Além disso, nós revalidamos todas as taxas cinéticas de kbind e kdiss monolécula usando um critério de co-localização que requeria a co-localização dos sinais fluorescentes das proteínas mCherry-HRas e eGFP-cRafRBD (Suplemento Fig. S6). Assim, a interação HRas-cRafRBD deve, de fato, ter uma rotação rápida, algumas vezes por segundo11,12.
Visualização de complexos de encontro na interação Ras-RafRBD
Análise detalhada da frequência de ligação da FCas-cRafRBD (kbind) indica a existência de complexos de encontro pré-equilibradores rápidos17,18,19,20,21, que são intermediários de interação proteína-proteína solta que devem ser povoados antes da formação do complexo final FCas-cRafRBD (Fig. 2). Quando aumentamos a concentração de eGFP-cRafRBD de 5 para 50 nM, o kbind mostrou um aumento parabólico (Fig. 2a), que pode ser melhor ajustado à equação de 
com um coeficiente de Hill (n) de 1,1 (22,23), uma constante de dissociação (K1) de 43 nM para formação de complexos de encontro, e um κon de 2.16 s-1 nM-1, que é a taxa cinética de formação do estado limite final de um complexo de encontro (Métodos Suplementares e Fig. S7 Suplementar). kdiss, por outro lado, é em grande parte constante para as concentrações de eGFP-cRafRBD que estudamos (Fig. 2b). Estas taxas cinéticas medidas com o nosso co-IP monolécula em tempo real são muito consistentes com relatórios anteriores utilizando ensaios bioquímicos a granel (Tabela Suplementar S1). Uma nota é que assumimos uma conformação predominante para o complexo final HRas-cRafRBD. Embora nossa suposição seja corroborada pelas distribuições unimodais da intensidade do pico de fluorescência (Figura Suplementar S8), não podemos descartar completamente a possibilidade de existirem múltiplas conformações para o complexo HRas-cRafRBD com múltiplos caminhos que levam a elas.
(a) kbind em função da concentração de cRafRBD. Um aumento linear em kbind é mostrado como uma comparação. b) kdiss em função da concentração de cRafRBD. kblinking do experimento na Fig. 1j é mostrado como uma comparação. As barras de erro denotam s.e. (n>180). (c-e) Traços em tempo real da interação HRas-cRafRBD. Note que a fluorescência de fundo aumenta com a densidade da HRas de superfície. Usamos a mesma concentração de presas de =10 nM. (f) A fluorescência de fundo aumenta em função da densidade da HRas da superfície. Três conjuntos de dados, obtidos com 10 nM (círculos vermelhos), 20 nM (triângulos verdes) eGFP-cRafRBD e 20 nM recombinantes eGFP (diamantes azuis), são normalizados pelo correspondente nível de fluorescência de fundo medido a uma baixa densidade de Ras na superfície de 0,38 HRas por μm2. As barras de erro denotam s.d. (n>100). (g) Frequência de pico de uma molécula como função da fluorescência de fundo. O conjunto de dados obtido com 10 nM eGFP-cRafRBD é utilizado. As barras de erro denotam s.e. (n>100).
Remarkably, nós podemos visualizar os complexos de encontro variando a densidade de superfície da HRas. Se a fluorescência de fundo for um produto simples do movimento Browniano do eGFP-cRafRBD, ela dependeria apenas da concentração de cRafRBD. Entretanto, a fluorescência de fundo aumenta acentuadamente com a densidade da superfície de HRas, embora as concentrações de cRafRBD sejam mantidas constantes (Fig. 2c-f). A uma alta densidade de Ras de 6,4 HRas por μm2, a fluorescência de fundo total torna-se três vezes maior do que a observada a 0,38 HRas por μm2 (Fig. 2c). Nossa simulação numérica mostra que a presença de processos de ligação paralela em um determinado ROI só pode ser responsável por menos de 5% do aumento observado (Figura Suplementar S9). Além disso, quando as proteínas de presa foram alteradas para eGFPs recombinantes, que não interagiram com as proteínas de HRas de superfície imobilizada, sua fluorescência de fundo foi essencialmente invariante na faixa de densidade de HRas que estudamos (Fig. 2f, diamantes azuis). Assim, como temos uma densa população de HRas ativa na superfície, parece haver mais moléculas de eGFP-cRafRBD que permanecem acima da superfície do que seria esperado pela difusão Browniana pura. Estes complexos de encontro surgem de rápidas interacções pré-equilibratórias entre a HRas e as proteínas cRafRBD24, das quais a dinâmica está para além da nossa resolução temporal.
A seguir questionamos se os complexos de encontro servem de facto como substratos para o complexo final HRas-cRafRBD. Para isso, avaliamos a frequência dos picos de fluorescência gerados por uma única proteína HRas imobilizada de superfície. Raciocinamos que se os complexos de encontro forem verdadeiros em intermediários de caminho para o complexo final Ras-RafRBD, a frequência de picos de uma molécula deve crescer com a fluorescência de fundo crescente, apesar da mesma concentração volumétrica de cRafRBD. Para obter a frequência de pico monomolécula em ambientes densos de HRas, medimos kbind usando um ROI menor de 3 por 3 pixels (0,18 μm2) e dividimos o valor kbind medido pelo número médio de HRas em cada ROI de 3 por 3 pixels (Fig. Suplementar S10). De modo geral, esta frequência de pico monomolécula aumentou com a fluorescência de fundo (Fig. 2g, 10 nM eGFP-cRafRBD utilizado). Nossa observação sugere que as proteínas concentradas a jusante na forma de complexos de encontro levam à formação do complexo Ras-Raf com uma freqüência aumentada.
Análise de co-IP monomolécula de proteínas de sinalização em cancros
Demonstramos até agora a medição em tempo real da cinética de interação proteína-proteína durante a co-IP monomolécula. Nestas experiências, no entanto, a isca e as proteínas de presa são fundidas a etiquetas proteicas fluorescentes, colocando a questão de saber se podemos estender esta técnica às proteínas nativas. Para este fim, expressamos HRas mutantes (G12V) em uma linha de células epiteliais mamárias humanas não-tumorigênicas (MCF10A) para transformá-las em células cancerosas25 (Fig. 3a). Estas células transformadas, que mostraram crescimento livre de soro (Figura Suplementar S11), formaram tumores quando injetadas na almofada de gordura mamária de ratos imunocomprometidos (Fig. 3b). Os tecidos tumorais foram obtidos 17 dias após o xenoenxerto, e os tecidos controle foram preparados a partir das mesmas partes dos ratos nus não tratados.
(a,b) Transformação de células MCF10A em células cancerosas por transdução retroviral de HRas (G12V). Esta mutação de ponto único é conhecida por tornar a HRas constitutivamente ativa. A injeção de células cancerosas em mamárias de ratos nus leva à formação de tumores. Barra de escala, 5 mm. (c) Esquema de análise de manchas ocidentais monomoléculas. A competição entre as células e a sonda Ras para a ligação ao anticorpo primário reduz o número de Ras da sonda especificamente ligada à superfície, o que consequentemente reduz o número de pontos fluorescentes. Note que como cada anticorpo primário se liga a duas proteínas Ras, uma mancha fluorescente desaparece quando ambos os braços da cadeia de luz são ocupados por Ras celulares. (d) Medida protópica de mancha ocidental monolécula. 298 nM mCherry-HRas foi usado como proteína alvo. Com 32,5 nM eGFP-HRas como sonda, a concentração da proteína alvo foi medida para ser de 288±1,4 nM. Barra de erro denota s.d. (n=20). (e) Níveis de expressão de Ras medidos através do processo de tumorigenese de a,b. Barras de erro denota s.d. (n=20). (f) Esquema de imagem co-IP em tempo real para HRas nativas. (g-j) Traços de imagem co-IP em tempo real. As concentrações de HRas utilizadas para a extração são 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) e 49 nM (j). A frequência de picos de fluorescência foi significativamente aumentada para o extrato de tecido cancerígeno quando a HRas pull-down foi aumentada de 1,6 para 22 HRas por μm2 (g versus h). Isto não foi observado com o extrato do tecido controle (i versus j). (k) Esquema de inflação kbind. Sob condições esparsas de iscas activas na superfície, obtém-se uma kbind constante, monomolécula, mesmo quando a superfície de tracção das iscas é aumentada (esquerda dois painéis). Entretanto, além do limiar de 0,6 iscas ativas por μm2, mais de uma isca está presente por ROI em média. Estas iscas múltiplas têm o efeito de aumentar o kbind medido a partir de cada ROI (painel direito). (l) kbind em função da tração HRas para baixo. Barras de erro denotam s.e. (n>180).
Num esforço para descrever esta tumorigenese quantitativamente, usamos camadas tandem de anticorpos; um anticorpo secundário biotinilado de superfície e um anticorpo primário específico de Ras1,2. Isto permitiu a captura de Ras nativas, não rotuladas, assim como de Ras rotuladas (Fig. 3c). Primeiro rastreamos quantitativamente os níveis de expressão de Ras através do processo de tumorigenese. Extratos de células ou tecidos foram misturados com um lisado celular HEK293 diluído, que continha a sonda Ras (eGFP-HRas) de concentração conhecida. Sob as condições de reação que saturam completamente os locais de ligação do anticorpo primário, esta mistura leva a uma competição por ligação de anticorpos específicos de Ras entre a sonda Ras e Ras celular alvo (Fig. 3c, esquerda). O número de moléculas da sonda Ras ligadas aos anticorpos primários diminui à medida que a concentração de Ras celular alvo aumenta. Esta ligação competitiva diminui o número de pontos de fluorescência na superfície (Fig. 3c, direita), que segue a equação de 
quando normalizada para uma condição de ligação da sonda Ras apenas (Suplemento Fig. S12). Medindo o número de moléculas da sonda ligada em várias diluições diferentes, fomos capazes de medir de forma específica e robusta a concentração molar de Ras celulares alvo em extratos de células e tecidos (Fig. 3d e Suplemento Fig. S12). Esta análise de mancha ocidental monomolécula indicou níveis de expressão de Ras de 42 e 59 nM em 1 mg ml-1 de extratos de células MCF10A cancerosas e tecidos tumorais de xenograft, respectivamente, enquanto um nível de base de 7 nM foi medido em 1 mg ml-1 de extratos do tecido de controle (Fig. 3e).
Outras vezes, também fomos capazes de replicar a imagem de co-IP monomolécula em tempo real a partir das Figs. 1 e 2 nesta superfície de captura de Ras nativa. Após puxar para baixo HRas de extratos de tumor ou tecido de controle na superfície do anticorpo tandem, aplicamos um lisado de células da sonda, um lisado de células HEK293 diluído com 20 nM eGFP-cRafRBD proteínas de presa (Fig. 3f). Analisamos traços de co-IP em tempo real para determinar as taxas cinéticas kbind e kdiss (Fig. 3g-j). É importante notar que a informação de concentração da análise de mancha ocidental monolécula (Fig. 3e) foi crucial para assegurar uma concentração específica de HRas para cada puxada para baixo quando o tumor e extratos de tecido de controle tinham níveis de expressão de HRas díspares. Usando os dados de calibração para a extração superficial para baixo (Suplemento Fig. S13), a informação de concentração foi finalmente convertida para uma densidade superficial específica de proteínas de HRas pull-down (Fig. 3g-j).
Estudamos sistematicamente a mudança de kbind enquanto aumentamos precisamente a densidade superficial de proteínas de HRas pull-down (Fig. 3k). Presumimos que como resultado da regulação celular, apenas um subconjunto de proteínas de HRas na superfície deve estar no estado carregado de GTP e mostrar eventos de ligação ativa com as proteínas de presa. Sob uma condição esparsa em que a distância entre as moléculas vizinhas ativas da HRas é muito maior que o diâmetro de cada ROI, a cinética observada de cada ROI deve ser independente da imobilização total da superfície da HRas e simplesmente relatar a atividade das proteínas de um-HRas (Fig. 3k, esquerda dois painéis e Suplemento Fig. S14). À medida que a superfície se torna mais preenchida com FCas ativa, deve haver um limiar no qual começa a haver mais de uma molécula de FCas ativa por ROI. Uma vez passado este limiar, as moléculas extra ativas de HRas em cada ROI produziriam picos de fluorescência adicionais que consequentemente inflacionariam o kbind (Fig. 3k, painel direito e Suplemento Fig. S14). De fato, observamos essa tendência bifásica de kbind para o tecido tumoral, com um limiar de ~3 HRas puxado para baixo por μm2 (Fig. 3l).
Assim, abaixo do limiar de inflação de kbind, a cinética dos picos observados refletiria em grande parte a atividade de moléculas de um-HRas. Notavelmente, a 1,6-1,9 HRas puxadas para baixo por μm2, valores kbind similares de 0,28 s-1 e 0,22 s-1 foram observados para as proteínas derivadas do tumor e das proteínas derivadas do tecido controle da HRas, respectivamente (Fig. 3l). As medidas de kdiss também foram muito semelhantes em 2,5 s-1 (Fig. Suplementar S15). Consequentemente, a FCas mono oncogênica derivada do tumor teve uma constante de dissociação aparente de 180 nM, e esta foi muito semelhante à constante de dissociação de 230 nM para a FCas ativa do extrato do tecido controle. Nossas observações indicam um fato crucial que a atividade monomolécula da FCas oncogênica não é dramaticamente diferente da de uma FCas do tipo selvagem ativada.
Então, o que distingue este estado cancerígeno do estado normal? O limiar de inflação kbind permite-nos quantificar outra importante estatística de proteínas de sinalização celular, a proporção de proteínas de HRas que se ligam activamente à cRafRBD. Intuitivamente, o limiar para a inflação de kbind deve corresponder a uma densidade superficial específica de proteínas ‘activas’ de isco. Em nosso esquema de imagens, esse limiar foi encontrado em 0,6 iscas ativas por μm2, que não depende dos tipos detalhados de iscas e proteínas de presa (Fig. Suplementar S13). Como o limiar para a inflação de kbind foi observado em um total de 3 FCas retiradas por μm2, a fração de FCas ativas foi diretamente estimada em cerca de 20% para o tecido tumoral. Em contraste, não foi possível observar a inflação de kbind quando mesmo 25 proteínas de HRas foram puxadas para baixo por μm2 a partir do tecido controle (Fig. 3l). Estas observações indicam que a FCas oncogênica derivada do tecido tumoral tem uma fração ativa maior que a FCas derivada do tecido controle em uma ordem de magnitude.
Finalmente questionamos se esta maior proporção de Ras ativos poderia ser uma simples consequência da superexpressão da FCas no tumor xenografado. As proteínas de HRas superexpressas poderiam ser mais numerosas do que os parceiros de ligação putativos, deixados disponíveis para ligação ao Raf rotulado com eGFP. Para abordar diretamente esta questão, testamos duas linhas de células humanas de câncer de mama, MCF-7 que tem KRas do tipo selvagem e MDA-MB-231 que tem uma forma mutante de KRas (G13D; Fig. 4). Em particular, as células MDA-MB-231 são conhecidas por apresentarem dependência oncogênica ao gene KRas mutante e dependem criticamente de sinais aberrantes de KRas para sua sobrevivência26,27. Utilizando estas duas linhas celulares, também somos capazes de determinar se os nossos métodos se aplicam à sinalização KRas, que tem uma importância fundamental no diagnóstico molecular e no tratamento de muitos cancros humanos28.
(a,b) Análise de KRas monomolécula ocidental de níveis de expressão de KRas. KRas rotulado com eGFP foi usado como a sonda Ras. O nível de expressão do tipo selvagem KRas na linha MCF-7 foi medido para ser 17,3±1,3 nM, enquanto que o do mutante G13D KRas na linha MDA-MB-231 foi medido para ser 5,5±0,3 nM por 1 mg ml-1 de extratos. As barras de erro denotam s.d (n=200). (c) kbind em função de KRas pull down. Note o mesmo valor de kbind compartilhado pelo tipo selvagem e mutante KRas na região da cinética monomolécula (a linha plana comum). O limiar para kbind foi medido para 1,2 KRas puxados para baixo por μm2 para o KRas mutante da MDA-MB-231, o que deu uma fração ativa estimada de 50%. Este valor foi uma ordem de magnitude superior a 6% do tipo selvagem KRas de MCF-7, que teve o limiar de 10 KRas puxado para baixo por μm2. Barras de erro denotam s.e. (n>150).
Retiramos diretamente KRas desses extratos de células usando um anticorpo primário específico de KRas. Nossa análise de mancha ocidental monolécula mostrou que o KRas tipo selvagem em células MCF-7 tem uma concentração maior (17 nM) do que o KRas mutante em células MDA-MB-231 (5,5 nM em extratos de 1 mg ml-1; Fig. 4a e Suplemento Fig. S16). Considerando a dependência de KRas oncogene das células MDA-MB-231, o seu menor nível de expressão de KRas foi uma observação bastante inesperada. Além disso, a cinética de sinalização monomolécula para o KRas tipo selvagem e mutante é essencialmente a mesma (Fig. 4c, a linha plana comum; veja Suplemento Fig. S15 para kdiss). Por outro lado, o nosso co-IP monomolécula em tempo real resolve que o limiar de inflação kbind para o KRas mutante do MDA-MB-231 é identificado a 1,2 KRas puxado para baixo por μm2, enquanto o limiar é observado a ~10 KRas puxado para baixo por μm2 para o KRas do tipo selvagem de MCF-7 (Fig. 4c). Como a inflação kbind sempre ocorre a 0,6 iscas ativas por μm2, esses limiares díspares indicam diretamente que a fração ativa do KRas mutante que se liga fortemente ao seu alvo a jusante (15 nM cRafRBD) é 50%, quase uma ordem de magnitude superior a 6% mostrada pelo KRas do tipo selvagem. Assim, a fração ativa maior exibida pelo Ras oncogênico mutante não é claramente um artefato de superexpressão, pois o KRas mutante foi expresso em níveis mais baixos, mas mostrou uma fração ativa maior do que o tipo selvagem.