Axial Resolution

1.43.2 O Caso das Técnicas de Microscopia de Super-resolução

Resoluções laterais e axiais no microscópio de luz são fundamentalmente difrações limitadas na relação entre o comprimento de onda da luz e a abertura, ou ângulo de aceitação, da lente objetiva utilizada para a imagem, conforme descrito por Ernst Abbe em 1873. Na dimensão lateral, este limite de resolução é de aproximadamente 200 nm, e na dimensão axial, o limite é de aproximadamente 500 nm. O limite de difração da microscopia óptica provém das limitações fundamentais da óptica utilizada na formação da imagem. Se considerarmos a imagem formada por uma fonte de luz esférica de subresolução, verificamos que a imagem que resulta de uma óptica de microscópio sem aberrações, mesmo perfeitamente corrigida, não é descrita por uma simples esfera. Na verdade, observa-se uma complexa distribuição de intensidade 3D no ponto focal, e esta distribuição de intensidade 3D pode ser descrita matematicamente pela função de espalhamento do ponto (FPS) (Figura 1). O máximo central da FSP contém 86,5% da intensidade total de energia disponível. Nas dimensões lateral e axial, a intensidade de energia restante é mapeada em uma série de máximos e mínimos de forma rotacionalmente simétrica. É a interacção das FPS de características de imagem adjacentes que determina, em última análise, o limite de resolução da difracção do microscópio luminoso.

Figure 1. XY (a) e XZ (b) mapas de intensidade de uma função de propagação de pontos ideal.

Quando dois objetos se aproximam no espaço, suas PSFs se sobrepõem e logo os dois objetos não podem ser discriminados um do outro. A sobreposição mínima de duas FPS que pode ser tolerada antes da perda da capacidade de distinguir os dois um do outro foi descrita como sendo o ponto em que a intensidade cai aproximadamente 25% entre as duas FPS. O ponto em que essa queda de intensidade é alcançada é equivalente à distância entre o máximo central e o primeiro mínimo da FSP. É muito difícil determinar com precisão essa distância, pois é difícil posicionar com precisão o mínimo, e em vez disso, utiliza-se o meio-máximo de largura total (FWHM) do máximo central da FPS.

De ambas as equações, vemos que as resoluções lateral e axial dependem da abertura numérica do sistema óptico que recolhe a luz e do comprimento de onda da própria luz. O poder de resolução melhorado provém do uso de lentes objetivas de alta abertura numérica e comprimentos de onda de luz mais curtos. Outros factores como o brilho relativo dos dois objectos (contraste) influenciam esta distância mínima resolúvel. Em termos práticos, na imagem do microscópio, tanto a abertura numérica óptica suficiente como o contraste suficiente são necessários para visualizar com precisão os detalhes subcelulares.

Diminuir o comprimento de onda da iluminação na faixa ultravioleta para melhorar os limites de resolução das sondas fluorescentes, e empurrar os limites das correções ópticas e as propriedades de transmissão da trajetória óptica do microscópio. Outras complicações vêm do uso da iluminação ultravioleta em estudos com células vivas onde muitos investigadores notaram os efeitos deletérios desses comprimentos de onda na viabilidade celular a longo prazo. Os designs ópticos modernos melhoraram as aberturas numéricas das lentes, embora a melhoria real neste aspecto tenha vindo apenas com o uso de meios de montagem e materiais de vidro de cobertura exóticos. Ambas as estratégias não conseguem fazer mais do que uma modesta melhoria na resolução e vêm à custa de serem impraticáveis para estudos de células vivas.

Microscopia confocal biológica, que usa uma abertura de orifício para melhorar o contraste in-focus pela remoção eficaz da luz difusa dos planos do objeto fora de foco, tornou-se uma ferramenta de imagem padrão no estudo das relações estrutura-função celular. A melhoria na visualização do plano da imagem in-focus permite alcançar mais facilmente os limites práticos de difração de resolução quando o instrumento é ajustado criticamente. Teoricamente, com aberturas de orifício de menos de 1 unidade Airy, as resoluções lateral e axial realmente melhoram para um limite de 1,4 vezes o do caso do microscópio de campo largo. Entretanto, na prática, os diâmetros dos orifícios inferiores a 1 unidade Airy fornecem muito pouca luz para a imagem biológica, já que grande parte da emissão in-focus é rejeitada pelo orifício juntamente com a indesejada luz fora de foco. Para imagens biológicas, onde geralmente se luta para obter o sinal de emissão, a rejeição de uma parte deste sinal limitado para um pequeno ganho de resolução é impraticável. De fato, quando o sinal de emissão da amostra é limitado, geralmente se opta por abrir o orifício para diâmetros maiores que 1 unidade Airy, a fim de coletar mais sinal às custas de uma maior espessura da fatia óptica. Nestes diâmetros de orifício, a resolução do microscópio confocal é essencialmente a mesma que a de um microscópio fluorescente convencional de campo largo.

Isto não quer dizer que não se possa detectar objectos que são menores que o limite de resolução – a detecção mesmo ao nível de moléculas únicas é possível, e agora relativamente simples usando tecnologias modernas de detecção. A remoção completa da iluminação direta que entra na objetiva em microscopia de campo escuro cria um excelente contraste de modo que mesmo a pequena quantidade de luz espalhada por objetos limitados por difração como microtubos (25 nm de diâmetro) é facilmente observada. A microscopia de fluorescência também proporciona excelentes condições de contraste que podem permitir a observação e o registo de objectos com dimensões muito abaixo do limite de difracção de resolução. Com a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF), o contraste é melhorado a partir da microscopia padrão de fluorescência de campo amplo, limitando a excitação axial a algumas centenas de nanômetros da interface fluído-vidro, usando a energia de luz evanescente e próxima do campo para a excitação de fluoróforos. Sob estas condições, mesmo a mobilidade monomolécula pode ser rastreada ao longo do tempo dentro de uma secção óptica muito fina. No entanto, nem o campo escuro nem a microscopia TIRF melhoram a resolução do sistema óptico – ambas as técnicas dependem de grandes diferenças de contraste entre o objeto de interesse e o fundo para permitir a detecção de subresolução.

Pushing beyond the classical diffraction resolution limits has represent a great challenge in modern light microscopy. Os benefícios de melhorar a nossa capacidade de resolver detalhes mais finos a partir do microscópio óptico são óbvios. Uma maior resolução permitiria uma descrição estrutural mais precisa das organizações moleculares fundamentais para a fisiologia e comportamento celular normal e anormal. As dissecções moleculares e bioquímicas só até agora revelam a complexidade das organizações funcionais, como as encontradas nos contatos focais de adesão. Sendo capazes de visualizar diretamente, com resoluções aproximando-se da dimensão molecular, estas organizações funcionais aumentariam substancialmente nossa compreensão das inter-relações moleculares e mudanças na organização relacionadas aos estados funcionais ou fisiológicos. Recentemente, vários pesquisadores exploraram várias estratégias diferentes para fornecer melhorias substanciais (2 a 10 vezes ou melhor) nos limites clássicos de resolução lateral e axial. Estas técnicas enquadram-se em duas categorias gerais: as que dependem de mudanças na iluminação do espécime, e as que utilizam estratégias de detecção monomolécula juntamente com a dimensão temporal para construir uma imagem super-resolvida.

Para os fins deste artigo, as técnicas que levaram ao desenvolvimento e introdução de instrumentos comerciais por vários fabricantes foram escolhidas. A utilização deste critério específico na seleção dos métodos discutidos abaixo não deve de forma alguma ser interpretada como um endosso a estas técnicas em relação a outras que foram introduzidas na literatura. medida que se desenvolve mais trabalho neste campo em rápida mudança, pode ser que os novos métodos e abordagens ultrapassem os descritos abaixo. No entanto, a introdução destes instrumentos comerciais no mercado permite a um vasto leque de biólogos de diferentes disciplinas aplicar métodos de super-resolução às suas próprias questões biológicas específicas, retirando estes métodos dos laboratórios especializados de desenvolvimento. Os leitores são encorajados a investigar por si próprios as imagens de alta qualidade contidas no material suplementar online que acompanha muitos dos artigos referenciados.