Biotinilação eficiente e purificação em uma única etapa dos fatores de transcrição marcados em células de mamíferos e ratos transgênicos

Resultados

Biotinilação eficiente do GATA-1 marcado em células transferidas. O esquema para a biotinilação específica in vivo de proteínas marcadas em células de mamíferos está delineado na Fig. 1A. De acordo com este procedimento, um pequeno (23 aa) peptídeo tag é fundido à proteína de interesse e coexpresso em células juntamente com BirA, uma proteína bacteriana ligase de biotina (20). O peptídeo tag usado foi previamente isolado de uma biblioteca de peptídeos sintéticos rastreados para biotinilação mediada pela BirA, que ocorre especificamente no resíduo de lisina do tag (16). Pesquisas em bancos de dados de proteínas não identificaram proteínas naturais que possuam um motivo de seqüência semelhante ao do peptídeo tag.

A proteína que marcamos no teste deste sistema foi o fator essencial de transcrição hematopoiética murina GATA-1 (para revisão, ver ref. 25). O tag foi fundido N-terminalmente ao GATA-1 e expresso sob o controle de uma cassete de expressão humana β-globina em células MEL, que pode ser induzida a sofrer diferenciação celular eritróide terminal (22). BirA também foi clonado e expresso em células MEL usando o cassete de expressão da globina humana. Clones correspondentes a transfectantes estáveis simples e duplos para GATA-1 e BirA marcados foram isolados e inicialmente analisados para expressão de ambas as construções. No caso do GATA-1, a análise de Western blot analysis usando um anticorpo GATA-1 detecta a proteína tagged mais lenta, bem como o GATA-1 endógeno em extratos nucleares de células transfectadas (Fig. 1B, faixas 1 e 2). A expressão de BirA foi analisada ao nível do RNA (dados não mostrados).

Em seguida, testamos, em transfectantes estáveis selecionados, se a proteína GATA-1 marcada foi biotinylated por BirA. O ensaio de extratos nucleares de clones de células MEL usando um conjugado de estreptavidina-HRP mostrou um sinal robusto correspondente à proteína GATA-1 marcada, detectável apenas na pista do duplo transfectante GATA-1/BirA marcado (Fig. 1B, pista 5). Não é visível a biotinilação do GATA-1 marcado na ausência do BirA (Fig. 1B, pista 6). Estes achados confirmam que a proteína BirA é sintetizada de forma ativa nas células MEL transfectadas. Além disso, muito pouca biotinilação de fundo não-específica é observada em extratos nucleares de células MEL expressando apenas BirA (Fig. 1B, pista 7). Concluímos, portanto, que a expressão da proteína-biotina ligase bacteriana BirA em células MEL pode especificamente biotinilatar um fator de transcrição de mamífero portador de um único peptídeo tag.

Em seguida, testamos a eficiência da biotinilação ligaseando GATA-1 tagged em extratos nucleares brutos a estreptavidina paramagnética Dynabeads (Fig. 1C). A análise do material eluído dos grânulos mostrou que quase toda a proteína GATA-1 marcada foi ligada (compare a pista 2 com as pistas 1 e 3, Fig. 1C). Reprobing the same filter with streptavidin-HRP shows ≈100% efficiency in the biotinylation and capture of tagged GATA-1 by the beads (Fig. 1C, faixas 4 e 5). Além disso, de acordo com o que foi visto na Fig. 1B, há pouca ligação de fundo das proteínas biotiniladas endógenas aos grânulos, como detectado pela estreptavidina-HRP (Fig. 1C, pista 5). Estes dados demonstram que o GATA-1 marcado é muito eficientemente biotinilado e recuperado de extratos por ligação de estreptavidina, com insignificante biotinilação de fundo.

Purificação em um único passo do GATA-1 biotinilado a partir de extratos nucleares brutos por ligação de estreptavidina. Também exploramos a viabilidade de uma purificação em uma única etapa no isolamento do GATA-1 biotinilado a partir de extratos nucleares brutos ligando-se diretamente a contas de estreptavidina sob restrição moderada (150 mM NaCl/0,3% Nonidet P-40/200 ng/μl albumina de soro de frango). Primeiro tentamos uma ligação de controle a partir de 5 mg de extratos nucleares brutos de células MEL expressando apenas BirA (Fig. 2, faixa 4). O material eluído consistiu de aproximadamente cinco bandas fortemente coradas contra um pano de fundo de bandas muito mais fracas (Fig. 2, pista 5). Identificamos as proteínas de ligação ao fundo excisando toda a faixa do gel e analisando-a por cromatografia líquida – MS tandem. As proteínas assim identificadas são classificadas na Tabela 1 de acordo com a função biológica e o compartimento celular, conforme definido pelo Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org). Os resultados mostraram que as proteínas de fundo mais abundantes identificadas foram as carboxilases naturalmente biotiniladas e as enzimas associadas, que coincidiram em grande parte com as bandas de coloração intensa. Também encontramos ligação de fundo de proteínas nucleares abundantes envolvidas no processamento de mRNA, tais como fatores de emenda, bem como de proteínas ribossômicas. Juntas, estas três classes de proteínas representaram >80% da ligação de fundo sob as condições usadas (Tabela 1). É notável que muito poucos peptídeos foram identificados como correspondendo a fatores envolvidos na regulação transcripcional (Tabela 1). Concluímos que a ligação de fundo a contas de estreptavidina se deve principalmente a proteínas biotiniladas endógenas, bem como a abundantes fatores nucleares envolvidos no processamento de mRNA e síntese e montagem de ribossomos, com muito pouca ligação não específica de fatores envolvidos na regulação/ativação transcripcional.

Em seguida, tentamos ligar uma quantidade similar de extrato nuclear bruto (5 mg) a partir de transfectantes duplos GATA-1/BirA marcados, sob as mesmas condições (Fig. 2, pista 2). O padrão de coloração da pista com o material eluído (Fig. 2, pista 3) foi significativamente diferente daquele observado com a ligação de fundo na pista 5, indicando um enriquecimento significativo em proteínas coelutantes com GATA-1 marcado (Fig. 2, pista 3 vs. pista 5). As proteínas biotiniladas GATA-1 e as proteínas coelutantes podem diluir-se ou competir pela ligação com as proteínas não específicas observadas na pista 5. O enriquecimento protéico visível na pista 3 pode assim corresponder a proteínas co-poluídas que interagem com o GATA-1. No material eluído, também observamos uma banda fortemente corada migrando com um tamanho semelhante ao esperado para GATA-1 marcado (Fig. 2, seta, pista 3). Confirmamos a presença do GATA-1 nesta banda por excisão em gel e EM. A análise detalhada de todas as proteínas copurificantes com GATA-1 marcado será publicada em outro lugar (P.R., F.G., e J.S., resultados inéditos). Em conjunto, estes dados demonstram a biotinilação quantitativa do GATA-1 marcado em células MEL e sua eficiente purificação a partir de extratos de proteína bruta em um único passo através da ligação direta a contas de estreptavidina, com poucas bandas de ligação de fundo correspondentes principalmente a proteínas biotiniladas endógenas e proteínas nucleares/nucleolares abundantes facilmente identificáveis.

Biotinilação Não Afeta as Propriedades de Interação Proteica ou de Ligação ao DNA do GATA-1. Como é possível que a adição do peptídeo tag e/ou biotinilação possa afetar as propriedades da proteína tagada, nós testamos se a biotinilação do GATA-1 ainda poderia sofrer interações protéicas com um parceiro conhecido do GATA-1, como o FOG-1 (26), e se ele poderia se ligar in vivo a alvos conhecidos do gene GATA-1, como o mouse βmaj globin promotor. Realizamos um experimento de puxar para baixo o GATA-1 biotinizado ligando extratos nucleares a contas de estreptavidina e testamos se o FOG-1 também foi copurificado. Encontramos o FOG-1 a ser puxado para baixo a partir de extratos que expressam GATA-1 biotinilado, mas não a partir de extratos que expressam apenas BirA (Fig. 3A, faixas 2 e 4). Encontramos também o FOG-1 a ser copurificado com GATA-1 biotinilado pela EM. Também realizamos um experimento de puxar a cromatina para baixo (ChIP) no qual a cromatina filtrada de células MEL ligadas ao formaldeído foi incubada com contas de estreptavidina, seguida pela eluição do material ligado e recuperação do DNA puxado para baixo. Usando primers específicos para o promotor βmaj, encontramos enriquecimento para essas sequências no DNA puxado para baixo a partir da cromatina das células que expressam GATA-1 biotinylated, mas não a partir de células que expressam BirA (Fig. 3B). Também descobrimos que a biotinilação não afeta a distribuição subnuclear normalmente observada com o GATA-1 (Fig. 5, que é publicada como informação de apoio no site da PNAS; ref. 27) e que o GATA-1 biotinilado apresenta um perfil de fracionamento bioquímico idêntico ao do GATA-1 endógeno em extratos nucleares de células MEL (dados não mostrados). Em conjunto, esses resultados fornecem fortes evidências de que as propriedades do GATA-1 não são afetadas pela etiquetagem da biotinilação. Além disso, esses dados também demonstram a aplicação da etiquetagem da biotinilação como alternativa aos anticorpos em métodos que envolvem uma etapa de purificação por afinidade, como pull-downs de proteínas ou um ensaio de ChIP.

Biotinylation Tagging in Transgenic Mice. A capacidade de isolar diretamente a proteína marcada com biotina de extratos crus em uma única etapa aumenta a perspectiva de usar esta abordagem na purificação de proteínas marcadas de fontes limitantes como os tecidos de camundongos. Portanto, testamos se a marcação com biotinilação mediada pela BirA também funcionaria in vivo em ratos transgênicos. Como a superexpressão do GATA-1 leva à letalidade embrionária em camundongos (28), testamos esta abordagem marcando o fator essencial de transcrição eritropoiética EKLF (29). O cDNA EKLF do rato foi marcado com a etiqueta de biotinilação e um epitópo duplo de hemaglutinina e microinjetado em ovos de camundongos para estabelecer linhas transgênicas de camundongos. Da mesma forma, linhas de camundongos transgênicos também foram estabelecidas através da microinjeção da construção do cassete de expressão BirA/eritróide. Linhas de camundongos transgênicos com expressão detectável de EKLF marcado e BirA em células eritróides foram selecionadas e cruzadas. A biotinilação in vivo da EKLF marcada foi avaliada em extratos nucleares preparados a partir dos fígados fetais de embriões pós-coito de 13,5 dias. A análise Western blot analysis com um anticorpo anti-EKLF detectado EKLF endógeno, bem como EKLF marcado, que foi visualizado como um doublet (Fig. 4, pista 1). A ligação dos extratos nucleares do fígado fetal a contas de estreptavidina mostra que apenas a banda superior do doublet é retida, sugerindo que é biotinylated (Fig. 4, faixas 2 e 3). Esta observação é confirmada pela sondagem da mesma mancha com streptavidin-HRP, que detecta apenas uma única faixa (Fig. 4, faixas 7 e 9). O doublet detectado pelo anticorpo EKLF é muito provavelmente devido à utilização diferencial de códons iniciadores de translação na etiqueta de biotinilação fusionada N-terminalmente (banda superior) e no epítopo de dupla hemaglutinina presente imediatamente abaixo, que também contém um códon iniciador (banda inferior). Como resultado, apenas a banda superior com a etiqueta de biotinilação serve como um substrato para BirA, demonstrando assim ainda mais a especificidade in vivo desta abordagem. A ligação de extratos nucleares a contas de estreptavidina também mostrou que uma proporção significativa (≈50%) de EKLF marcado é biotinilada nos fígados fetais de camundongos transgênicos. Especulamos que a diferença na eficiência da biotinilação entre células transfectadas e fígados fetais (além do uso de diferentes proteínas de fusão) pode refletir uma limitação in vivo na disponibilidade de biotina (a biotina é abundante na FCS usada para suplementar os meios de cultura celular) ou uma diferença nos níveis de expressão da BirA. Estes resultados demonstram que a biotinilação específica do EKLF marcado pela bactéria BirA também pode ser alcançada com alta eficiência in vivo em ratos transgênicos.