Centrifugação diferencial cinética limitada como alternativa barata e prontamente disponível à elutrinação centrífuga

Em muitas aplicações, a separação de células-alvo de misturas contendo outras células com densidades semelhantes, mas de tamanhos diferentes (seja ligeiramente ou substancialmente), é desejada. Exemplos incluem a geração de culturas celulares sincronizadas onde se isola células em um determinado estágio de seu ciclo (caracterizado pelo seu tamanho) (1-2), isolamento de corticotropos de outras células pituitárias (3), e classificação de várias subpopulações de monócitos (4). O método de escolha para separar populações celulares com base nas diferenças de velocidade de sedimentação (especialmente quando as diferenças de densidade não são significativas) é um processo chamado de elutrinação centrífuga (5). Aqui, os separadores (geralmente células) são submetidos a duas forças: (i) uma força centrífuga que os faz sedimentar com uma velocidade que é função da sua densidade e tamanho, e (ii) um fluxo convectivo na direcção oposta que dá uma velocidade fixa a todas as células. O fluxo e/ou a velocidade de centrifugação podem ser ajustados para recolher apenas as células cuja velocidade de sedimentação se situa numa determinada faixa. Embora este processo também tenha sido utilizado com sucesso para separar células bacterianas de matrizes nas quais elas estão presentes (6) (nossa aplicação de interesse), a necessidade de equipamento especializado serve como um impedimento para muitos laboratórios.

Embora existam vários protocolos que têm sido descritos para isolar bactérias de várias matrizes, tais como alimento (7-8), solo (9), e tapetes microbianos (10) que fazem uso de centrífugas de bancada prontamente disponíveis para separar células com base em diferentes velocidades de sedimentação, os protocolos recomendados muitas vezes parecem ser ad hoc. Por exemplo, Wang et al. (8) recomendam a centrifugação a <1000×g durante um período de tempo não especificado para remover detritos ao isolar as bactérias do queijo mole, seguido de centrifugação a 9000×g durante 3 min para recolher as bactérias. Da mesma forma, para isolar as bactérias da carne homogeneizada, Neiderhauser et al. (7) recomendaram a centrifugação a 100×g (por um período de tempo não especificado) para remover partículas de alimentos, seguida de centrifugação a 3000×g (novamente, por um período de tempo não especificado) para coletar bactérias. Em outros casos, os protocolos recomendados envolvem múltiplas rondas de centrifugação. Por exemplo, para isolar bactérias de esteiras microbianas, Bey et al. (10) recomendam não só a centrifugação a 500×g durante 15 min, mas também a ressuspensão do sedimento e uma repetição do procedimento quatro vezes. Similarmente, para isolar bactérias do solo, Bakken (9) recomenda a centrifugação repetida (por um “número de vezes”) do homogeneizado da amostra a 630-1060×g (por um tempo não especificado), seguida de ressuspensão e reomogenização. Abordagens semelhantes também foram propostas para isolar bactérias de caldo de cultura de sangue “positivo”. Para obter isolados puros de bactérias antes de determinar sua identidade usando a espectrometria de massa MALDI-TOF, Stevenson et al. (11) utilizaram um procedimento de centrifugação em múltiplas etapas envolvendo etapas de centrifugação sequencial durante “1-2 minutos” cada uma a 8500, 1000 e 13.000 RPM (valor em g não especificado) com ressuspensão da pastilha em diferentes tampões em cada etapa.

Estes protocolos citados não são de forma alguma os únicos exemplos de protocolos de centrifugação ad hoc caracterizados por escolha aparentemente arbitrária de velocidades e/ou tempos de centrifugação. Uma consequência importante desses protocolos ad hoc é que eles não fornecem nenhuma base racional com a qual outros possam desenvolver protocolos para isolar diferentes células alvo de outras matrizes/misturas de células. Por exemplo, é intuitivamente óbvio que a centrifugação prolongada resultará no assentamento de todas as partículas, enquanto que a centrifugação por uma curta duração apenas sedimentará as partículas mais rápidas, deixando a maioria das partículas mais lentas na suspensão. Determinar a velocidade/duração ótima para que a centrifugação isole a partícula alvo enquanto elimina outras, no entanto, continua sendo mais uma arte. Em outras palavras, protocolos atualmente relatados não fornecem uma base racional para modificação (determinando velocidades/ tempos ótimos de centrifugação) para outros objetivos de separação/isolamento relacionados.

Materiais e métodos

Teoria

Nosso método proposto para separar dois tipos de partículas que têm densidades similares, mas velocidades de sedimentação diferentes devido a diferenças de tamanho, é ilustrado na Figura 1. No início do processo (Figura 1(1)), a suspensão (caldo de hemocultura, no nosso caso) contendo os separandos (leucócitos ou leucócitos, hemácias ou hemácias, plaquetas e bactérias) é carregada como uma camada separada sobre um tampão denso transparente (Histopaque 1083, no nosso caso). A densidade do tampão é maior que a dos leucócitos (ρ = 1,06 – 1,08 g/mL (12)) e plaquetas (ρ = 1,05 – 1,07 g/mL (13)), mas menor que a das hemácias (ρ = 1,1 g/mL (14)) e bactérias (ρ = 1,105 g/mL para Escherichia coli (15)). Conforme a centrifugação prossegue, todas as partículas são impulsionadas para baixo, primeiro através da camada superior (meio de cultura de sangue), e depois para o tampão denso (o Histopaque). Enquanto as partículas com densidades maiores que as do tampão (hemácias e bactérias) sedimentam através do caldo de cultura de sangue e do tampão denso, os separadores menos densos (leucócitos e plaquetas) são excluídos deste último. Esse processo é semelhante ao protocolo recomendado para a separação de leucócitos e plaquetas do sangue total (16). Para nosso propósito, porém, este processo por si só é insuficiente porque enquanto algumas partículas indesejadas (leucócitos e plaquetas) são retiradas das partículas alvo (bactérias) com base nas diferenças de densidade, outras partículas com densidades semelhantes (leucócitos) permanecem. Para atingir nosso objetivo de coletar todas as células-alvo (bactérias) e eliminar todas as partículas indesejáveis (leucócitos), propomos levar o sistema ao estado descrito na Figura 1(4), e interromper o processo de centrifugação ali. Neste estado, todas as hemácias que, devido ao seu maior tamanho, têm uma velocidade de assentamento maior, são depositadas no fundo do tubo como um sedimento, enquanto todas as células bacterianas são dispersas no tampão denso.

A fim de alcançar este estado desejado, entretanto, uma série de restrições deve ser satisfeita. Primeiro, para garantir que todas as bactérias sejam coletadas no tampão, devemos dar tempo suficiente para que as bactérias que começaram no topo (Plano A) migrem através da camada de caldo de cultura de sangue (Médio 1) e para o Histopaque (Médio 2). Matematicamente, isto significa que:

onde, t é o tempo para o qual o processo de centrifugação é executado, l1 é o comprimento da coluna de caldo de hemocultura carregada, e vb1 é a velocidade de sedimentação das bactérias nesta camada. Este ponto no tempo (quando as bactérias que começam no Plano A acabam de cruzar o Plano B e entram no tampão) é representado na Figura 1(2).

Outra característica marcante deste estado é que as bactérias e as hemácias podem não ter formado “bandas” distintas no tampão até este momento. Enquanto as hemácias que começam em um determinado plano horizontal migram mais do que as bactérias localizadas similarmente, as hemácias que começaram no Plano A podem não ter ultrapassado as bactérias que começaram no Plano B (interface entre os dois líquidos). Para que isso aconteça e faça com que as hemácias e bactérias formem bandas distintas no tampão, a coluna do tampão tem de ser suficientemente longa. Não será possível a formação de bandas distintas se, por exemplo, a coluna do tampão se estender apenas tão profundamente quanto o nível mostrado pela linha tracejada na Figura 1(2). Matematicamente, a condição de que as RBCs (partículas de assentamento mais rápidas) começando no Plano A ultrapassem as bactérias (partículas de assentamento mais lentas) começando no Plano B pode ser expressa como:

onde l1 e l2 são os comprimentos das colunas de caldo de hemocultura (Meio 1) e tampão (Meio 2), respectivamente; vR1 e vR2 são a velocidade de sedimentação das hemácias no caldo e no tampão, respectivamente; e vb2 é a velocidade de sedimentação das bactérias no tampão. A equação acima pode ser rearranjada para render:

Além disso, seria desejável que todas as bactérias originalmente presentes no Meio 1 fossem coletadas no Meio 2. Isto significa que quando as bactérias que começam no topo (Plano A) atravessam a interface entre as duas fases (Plano B), aquelas que começam no Plano B não devem ter alcançado a parte inferior. Matematicamente, esta condição é expressa como:

onde, vb1 é a velocidade de sedimentação das bactérias no Médio 1. O acima pode ser rearranjado para render:

Se as Equações (3) e (5) forem satisfeitas, então o sistema atingirá o estado descrito na Figura 1(4) onde todas as hemácias atingiram o fundo do tubo e formam uma camada separada, mas nenhuma das bactérias o fez. (Elas estão todas em Médio 2). Este estado ocorre primeiro quando todas as hemácias (mesmo as que começam no plano A) atingem o fundo do tubo. Matematicamente, esse instante no tempo (t1) pode ser representado como:

O estado deixa de existir quando as bactérias (aquelas inicialmente presentes na interface, ou seja, no Plano B) começam a atingir o fundo do tubo. O tempo que isto ocorre (t2) é dado por:

Assim, para obter a melhor separação possível, deve-se (i) assegurar que os comprimentos das colunas dos dois meios satisfaçam as Equações (3) e (5); e (ii) que a duração do processo de sedimentação (tcentrifugação) seja dada por:

Continuar a centrifugação por mais tempo que t2 resultará na situação descrita pela Figura 1(5), onde algumas, ou todas, bactérias também sedimentam até o fundo. Para obter isolados puros da espécie desejada, o processo de centrifugação deve ser interrompido no estágio correspondente à Figura 1(4), a camada superior descartada, e o tampão denso retirado sem perturbar o sedimento no fundo. Se desejado, as partículas alvo podem ser centrifugadas e ressuspendidas em outros meios.

Esta “janela de operação” entre t1 e t2 é representada esquematicamente na Figura 2. Aqui, a abcissa mostra o tempo de centrifugação, enquanto a ordenada mostra a fração de partículas de RBC e bactérias que estão presentes no tampão denso (Medium 2). Para ambos, a fração inicialmente aumenta à medida que migram da camada superior, permanece constante por um período de tempo à medida que migram como uma banda através do tampão denso, e finalmente diminui à medida que se assentam na camada inferior. As hemácias de movimento mais rápido têm uma inclinação de subida/queda mais acentuada, assim como um período mais curto quando todas elas estão presentes no buffer denso. Durante a “janela de operação” (caixa nublada), praticamente todas as bactérias (∼%) estão presentes no buffer, mas praticamente nenhuma RBC (∼ 0%) está presente.

As velocidades de sedimentação das RBCs e das bactérias (que determinam os valores numéricos das restrições dadas pelas Equações 3,5 e 8) podem ser previstas com base em suas respectivas formas, tamanhos e densidades. A velocidade de sedimentação é dada (17) pela equação:

where, ρ e ρl são as densidades da partícula e do líquido, respectivamente, µ é a viscosidade do líquido, R é o raio efetivo da partícula, e g é a aceleração por gravidade/centrifugação. E. coli são bactérias em forma de bastão, com 2 microns de comprimento e 0,5 microns de diâmetro (18). Assim, podemos modelá-las como esferóides alongados, cujo raio de sedimentação efetivo (R) é dado (19) por:

onde a, e b são os meios comprimentos dos eixos maior e menor. Assim para E. coli, a = 1 mícron, e b = 0,25 mícron. Baseado nestes valores, esperamos que E. coli tenha uma velocidade de sedimentação de 26,7 microns/segundo através do líquido superior, e uma velocidade de 6,56 microns/segundo através do Histopaque 1083.

Por outro lado, as hemácias humanas são discos biconcavos, 7-8 microns de diâmetro e 2 microns de espessura (20). Elas podem, portanto, ser modeladas como esferóides oblatos cujo raio de sedimentação efetivo é dado (19) por:

>>

>

onde, a e b são a metade do comprimento dos eixos maior e menor, respectivamente. Com valores de 4 microns para a, e 1 micron para b, prevemos que quando submetidas à centrifugação usando nosso instrumento, um Eppendorf-5804, a uma força centrífuga relativa de 400×g, as hemácias sedimentarão com uma velocidade de 500 microns/segundo através da camada superior de densidade ∼1.02 g/mL (medida por nós), e 101 microns/segundo através do Histopaque (densidade = 1,083 g/mL).

A velocidade de sedimentação das partículas pode ser prevista com maior precisão, contabilizando as interações partícula/partícula. Estas interações partículo-partícula surgem quando o líquido deslocado para cima por uma partícula de assentamento impacta outras partículas imediatamente atrás ou ao lado da primeira, sujeitando a última a um aumento do arrastamento do fluido e assim reduzindo a velocidade (média) efetiva de sedimentação das partículas como um grupo. Este fenômeno é chamado de “assentamento dificultado” e precisa ser contabilizado quando a fracção volumétrica das partículas não é negligenciável. Uma série de expressões semi-analíticas ou empíricas estão disponíveis para calcular as velocidades de sedimentação efectivas para sistemas com sedimentação dificultada (21). Uma dessas abordagens é a Correlação Richardson-Zaki, onde a velocidade efetiva de assentamento (v′) é dada por:

onde v é a velocidade de assentamento da partícula na caixa não obstruída, e φ é a fracção volumétrica das partículas. O sangue é tipicamente diluído em caldo de cultura de sangue a uma diluição de 1:4 (22). Como o hematócrito (fração volêmica das hemácias no sangue) é tipicamente em torno de 0,4-0,45 (23), a fração volêmica resultante das hemácias em nossa amostra é em torno de 0,1. Se isso for levado em conta usando a Equação 12, então as velocidades de acerto previstas para as hemácias em Médio 1 e 2 são de 307 mícrons/segundo e 62 mícrons/segundo, respectivamente. Além disso, no momento em que as hemoculturas se tornam positivas, elas contêm ∼108 UFC (unidades formadoras de colônias) (células) de bactérias por mL de suspensão (24). No entanto, devido ao seu pequeno tamanho (raio ∼1 micron), a sua fracção de volume permanece inferior a 0,001, e o efeito de “colonização dificultada” pode ser negligenciado.

Dado um volume de amostra a partir do qual se deseja isolar o(s) tipo(s) de células de interesse, o fluxograma fornecido nos materiais suplementares (Figura Complementar 1) pode ser usado para orientar a escolha do tampão de sedimentação, prever as velocidades de sedimentação das células de interesse no referido tampão, determinar o volume apropriado (comprimento da coluna no tubo de centrifugação disponível) a ser usado, e finalmente calcular a duração ótima da centrifugação (janela de operação) usando a(s) centrífuga(s) disponível(s). Para o nosso sistema (5ml de caldo de cultura de sangue “positivo” carregado em tubos de centrifugação de 15ml), o processo é resumido na Tabela 1.

Tabela 1. Previsões teóricas de comprimentos mínimos de coluna e tempos mínimos/máximos de operação.

ValidaçãoExperimental

Primeiro preparamos um “caldo de cultura de sangue positivo” sintético, dispersando em 8ml de meio BACTEC Ped-Plus (Becton Dickinson, Sparks, MD), 2ml de sangue fresco (tirado de um voluntário), e 0.1ml de uma suspensão contendo ∼104 UFC (células) por mL de E. coli K-12 e incubando a mistura num misturador de nozes a 37°C durante a noite (12-14 h) para obter uma suspensão contendo ∼109 RBCs/mL e 108 UFC/mL de bactérias. 1,5 mL do caldo foi retirado em um tubo de micro-centrífuga (Eppendorf, Nova Iorque, EUA) e as células “peletizadas” por centrifugação. O sobrenadante foi retirado, e a massa de 1 ml medida usando uma balança (OHaus® GA-110) para estimar a densidade do líquido no caldo.

Adicionalmente, 5 mL do caldo positivo de hemocultura foi carregado em cima de 5 mL Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA). Vários desses tubos foram carregados em uma centrífuga de bancada Eppendorf-5804 e centrifugados por períodos de tempo variados (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min, e 90 min). No final do processo de centrifugação, o tubo foi suavemente removido, a camada superior (caldo de cultura de sangue) descartada, enquanto a camada Histopática foi recolhida sem perturbar o sedimento na parte inferior (se presente). A concentração de bactérias no líquido coletado foi testada usando métodos padrão envolvendo diluição em série, revestimento em ágar de soja Tryptic, incubação e contagem de colônias (25). As concentrações de hemácias foram obtidas pelo exame de uma alíquota da amostra em um hemocitômetro sob um microscópio (26).

Resultados e discussão

Resultados estão resumidos na Figura 3. As linhas representam o número teórico de células sanguíneas ou bactérias que se espera que estejam presentes na camada Histopaque (menos o sedimento no fundo) com base nas nossas previsões teóricas. Os símbolos sólidos representam a média de pelo menos três leituras dos números observados de hemácias (quadrados), e E. coli (diamantes). As barras de erro são o desvio padrão.

Como visto na Figura 3, o comportamento observado corresponde qualitativamente às nossas previsões; tanto para partículas densas (hemácias e bactérias), as concentrações na Histopaque inicialmente aumentam com o tempo, depois permanecem constantes durante uma certa duração e finalmente diminuem. Verificou-se, entretanto, que para as hemácias, todo o processo (elevação, estado estacionário e queda) ocorre um pouco mais lentamente do que o previsto. O efeito dessa taxa de sedimentação ligeiramente menor, felizmente, não afeta nossa janela de operação desde o início da janela é regido pelo tempo necessário para que todas as bactérias entrem no buffer denso. Quando isso ocorre, a concentração de hemácias no tampão denso é insignificante. Em outras palavras, a janela de operação prevista por nossos modelos (∼20 min a ∼75 min) é vista como contendo.

As bactérias mais comuns são também bastante pequenas (∼1 micron em comprimento característico) e suas densidades são semelhantes. (por exemplo, 1,1 g/mL para Pseudomonas (27); 1,13 g/mL para Streptococcus (28), e 1,135 g/mL para Bacillus (29)). Assim, é provável que tenham velocidades de sedimentação comparáveis às da E. coli tanto no caldo de cultura de sangue como no Histopaque-1083 e, consequentemente, a janela de operação também deve ser semelhante. Embora nossa janela de operação (∼20 min a ∼75 min) seja aplicável apenas para nosso hardware e parâmetros experimentais, nossa análise teórica fornece uma base para prever outras janelas de operação, não apenas para o propósito de isolar bactérias de caldos positivos de hemocultura usando diferentes hardware, mas também para isolar outras células-alvo de diferentes matrizes usando amortecedores densos. Este método também pode ser usado de forma sequencial para isolar um alvo de uma mistura contendo tanto espécies de assentamento mais rápido como de assentamento mais lento. Nesses casos, usaríamos o nosso método para primeiro eliminar todas as espécies que se movem mais rapidamente e, posteriormente, usá-lo para coletar a espécie alvo de assentamento mais rápido na mistura restante.