Efeito da macrocefalia Atractylodes macrocephala Koidz administrada oralmente Extracto de Água em Macrófagos e Resposta Inflamatória de Células T em Ratos

Abstract

O rizoma de Atractylodes macrocephala Koidz (AM) é um constituinte de várias prescrições de compostos Qi booster. Avaliamos respostas inflamatórias em macrófagos e células T isoladas de camundongos após a administração oral de AME (AM water extract). As células de exsudato peritoneal foram isoladas de camundongos infectados com tioglicolato e foram examinadas as alterações nos receptores do removedor. Macrófagos peritoneais foram estimulados com lipopolissacarídeo (LPS). As respostas séricas de citocinas à injeção intraperitoneal de LPS também foram avaliadas. Os esplenócitos foram isolados e sua composição e respostas funcionais foram medidas. O conteúdo de atractylenolide I e atractylenolide III, ingredientes anti-inflamatórios conhecidos, na AME foi de 0,0338 mg/g de extrato e 0,565 mg/g de extrato, respectivamente. A EMA aumentou o número de células SRA(+)CD11b(+) em resposta ao tioglicolato. Macrófagos peritoneais isolados do grupo da EMA não mostraram alterações em marcadores inflamatórios como o fator de necrose tumoral – (TNF-) α, interleucina- (IL-) 6, óxido nítrico sintase induzível e ciclooxigenase-2, mas exibiram uma diminuição na expressão da CD86. Curiosamente, a AME diminuiu os níveis séricos de TNF-α e IL-6 por injeção intraperitoneal de LPS. Em relação ao sistema imunológico adaptativo, a EMC aumentou a população de células T CD4(+) e maior expressão de moléculas do complexo de histocompatibilidade classe II no baço, e esplenócitos cultivados do grupo da EMC mostraram aumento da produção de IL-4 concomitante com diminuição da produção de interferon-γ durante a ativação das células T. AME promoveu o reabastecimento de macrófagos peritoneais durante a resposta inflamatória, mas sua atividade anti-inflamatória não parece ser mediada pela modulação da atividade dos macrófagos. AME também alterou o estado imunológico das células T CD4, promovendo a resposta Th2.

1. Introdução

Inflamação é uma resposta protetora para eliminar estímulos prejudiciais, e as células imunes são os principais participantes neste processo. Dependendo da modalidade de reconhecimento do antígeno e da capacidade de gerar resposta de memória, as células imunes são divididas no sistema imunológico inato e no sistema imunológico adaptativo . As células imunes inatas, tais como macrófagos e células dendríticas reagem instantaneamente ao antígeno com uma especificidade limitada de receptores . As células imunes adaptativas, constituídas por células T e células B, são específicas do antígeno, iniciam uma resposta ao antígeno que entrou no tecido linfóide periférico e geram uma resposta de memória . As células imunes inatas são os principais agentes nos estágios iniciais da inflamação, mas com o tempo, as células imunes adaptativas assumem o controle.

Os macrófagos residentes no tecido desempenham um papel fundamental na imunidade e integridade do tecido . A maioria dos macrófagos teciduais são derivados de precursores embrionários . Sob condições estáveis, as suas populações são mantidas através da sua longevidade e pela proliferação local, e alguns macrófagos são reabastecidos por células derivadas de monócitos sanguíneos. Durante a inflamação, os monócitos derivados da medula óssea são recrutados para o local e diferenciam-se em macrófagos . Os macrófagos eliminam patógenos e antígenos através da fagocitose e induzem respostas inflamatórias produzindo citocinas e enzimas como o fator de necrose tumoral (TNF-) α, interleucina- (IL-) 6, óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e ciclooxigenase- (COX-) 2. Além disso, os macrófagos são um tipo de células profissionais com antígenos (APCs) que apresentam antígenos para células T .

T, que consistem principalmente de células CD4 T e células CD8 T, são ativadas quando os receptores de células T (TCRs) entram em contato com peptídeos antigênicos ligados por moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) em APCs . As células T CD4, que representam mais de dois terços das células T, podem ser diferenciadas em várias células auxiliares T effector (Th), tais como Th1, Th2, Th17, T folicular helper e células reguladoras T . Entre estes subconjuntos, as células Th1 e Th2 foram os primeiros tipos a serem definidos. As células Th1 secretam altos níveis de interferon- (IFN-) γ e são eficientes na defesa contra patógenos intracelulares, ativando macrófagos, enquanto as células Th2 secretam interleucinas- (IL-) 4, IL-5 e IL-13 e protegem o hospedeiro da infecção por helmintos, recrutando eosinófilos e mastócitos . Embora essas células T helper sejam importantes para a defesa do hospedeiro, a ativação crônica de qualquer tipo de célula Th pode causar distúrbios imunomédicos. As células Th1 desempenham um papel crítico na auto-imunidade específica dos órgãos e nos distúrbios inflamatórios crónicos e as células Th2 são responsáveis pela inflamação alérgica .

O rizoma de Atractylodes macrocephala Koidz (AM), pertencente à Compositae, tem sido utilizado para o tratamento de defeitos funcionais no sistema digestivo, tais como perda de apetite, distensão abdominal e diarreia. De acordo com a medicina tradicional chinesa, o AM revigora o Qi, resolvendo a retenção anormal de líquidos no trato gastrointestinal. AM é um constituinte de várias prescrições de compostos Qi booster. Na medicina tradicional chinesa, uma das funções essenciais do Qi é a defesa. Por esta razão, pensa-se que as ervas potenciadoras do Qi melhoram o sistema imunitário. Como as ervas Qi boosting são tomadas de forma preventiva para melhorar o estado imunológico de indivíduos sem defeitos evidentes, é necessário avaliar como o sistema imunológico pode ser alterado em indivíduos normais após a administração de AM. Apesar do seu uso frequente, tem havido poucos estudos para explorar os efeitos do AM no sistema imunológico.

AM contém vários sesquiterpenóides bioactivos como o atractylenolide I, atractylenolide II, e atractylenolide III e poliacetilenos . Tratamento in vitro de macrófagos com atractylenolide I, atractylenolide III e alguns compostos poliacetilénicos inibidos de lipopolissacarídeos (LPS-) induzidos por TNF-α e expressão iNOS . A administração oral destes componentes lipossolúveis mostrou atividade anti-inflamatória em camundongos . No entanto, a maioria das preparações tradicionais à base de ervas são decocções à base de água, o que resulta em um baixo rendimento de componentes lipossolúveis farmacologicamente ativos. Além disso, os poliacetilenos podem ser facilmente destruídos em água fervente. Portanto, nós quisemos tratar se as respostas anti-inflamatórias ocorrem em macrófagos isolados de camundongos com AM extraído em água fervente (AME). Nós também examinamos o efeito da EMA na resposta inflamatória sérica. Finalmente, examinamos a composição e a resposta funcional dos esplenócitos para qualquer alteração no sistema imunológico adaptativo após a suplementação da EMA.

2. Materiais e Métodos

2.1. Preparação da Amostra

AM originária de Eusung (Coreia do Sul) foi comprada à E-Pulip Co., Ltd. (Lote. EPL1356-4) (Seul, Coreia do Sul). Uma amostra de voucher (# 2013-AM) foi depositada no Laboratório de Imunologia Herbal, Universidade Kyung Hee. Resumidamente, 100 g de amostra foram moídos, extraídos com 1 L de água deionizada (DW) em um aparelho de refluxo e manto de aquecimento por 2 h a 95°C, e filtrados através do papel de filtro Whatman número 2 (Whatman International, Kent, Inglaterra). O extrato foi concentrado utilizando um evaporador rotativo e liofilizado sob vácuo. O rendimento da AME foi de 37,7%. Para análise por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), 0,4 g de AME foi dissolvido em 10 ml de DW e filtrado por 5 min a 25°C. O extrato foi adicionado ao acetato etílico, agitado para misturar, e deixado em repouso por 1 min. A camada superior de acetato de etilo foi transferida e este procedimento foi repetido três vezes. A camada final de acetato de etilo foi concentrada e liofilizada.

2,2. HPLC

Amostras foram analisadas por um sistema HPLC de fase reversa (Shimadzu 20A, Kyoto, Japão) que consistiu de um auto-amplificador (SIL-20A), uma bomba binária (LC-20AD) e um detector de fotodíodos (SPD-20A) e foi equipado com uma coluna YMC-Triart C18 (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Japão). Os fluxos gradientes para o sistema de dois solventes (solvente A, ácido fosfórico 0,05% em água; solvente B, acetonitrilo) foram os seguintes: 85% A/15% B a 0 min, 85% A/15% B a 5 min, 50% A/50% B a 15 min, 50% A/50% B a 20 min, 40% A/60% B a 25 min, 40% A/60% B a 30 min, 15% A/85% a 35 min, 15% A/85% a 40 min, 85% A/15% a 42 min, e 85% A/15% a 45 min. A vazão da fase móvel foi de 1,0 ml/min com um volume de injeção de 10 μl. A detecção foi feita a 220 nm para atractylenolide III (Sigma, St. Louis, MO, EUA) ou a 280 nm para atractylenolide I (Sigma).

2,3. Animais

Ratos Balb/c machos de idade igual ou superior a uma semana foram obtidos de SamTaco (Osan, Coreia do Sul) e alojados numa instalação animal livre de agentes patogénicos com temperatura e humidade controladas, com um ciclo luz-escuro de 12-h. Todos os animais foram submetidos a 1 semana de ajuste antes dos experimentos. As doses foram determinadas usando um cálculo extrapolado a partir da diferença na área de superfície corporal entre um rato e um humano . A dose recomendada de AM para um humano adulto de 60 kg é de 8-24 g de planta crua por dia ou 3-9 g de extrato por dia (com base no rendimento de extração neste estudo). A dose para rato pode ser determinada da seguinte forma: uma dose humana equivalente de 50-150 mg/kg × 12,3 (o coeficiente de conversão) = uma dose para rato de 615-1,845 mg/kg. Com base nesta faixa de dose, escolhemos doses de 500 mg/kg e 2.500 mg/kg para este estudo. Os animais foram alocados aleatoriamente em grupos experimentais. AME foi administrada através de gavagem oral uma vez por dia durante 10 dias. Não houve diferenças no peso corporal entre os grupos durante o período experimental. O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Kyung Hee (KHUASP(SE)-15-012), e os ratos foram cuidados de acordo com as especificações do US National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals (1996).

2,4. Macrophage Preparation

Para isolamento de macrófagos, os ratos foram injetados intraperitonealmente com 2 ml de tioglicolato estéril a 3,5% (BD, Sparks, MD, EUA) 4 dias antes do sacrifício. Ao final da experiência, os camundongos foram sacrificados por luxação cervical e as células de exsudato peritoneal foram isoladas assepticamente por lavagem peritoneal com DMEM frio (Hyclone, Logan, UT, EUA) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS; Hyclone) e 1% de penicilina-estreptomicina. Após a centrifugação, as células foram ressuspendidas e contadas usando um Contador de Células TC20 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

2,5. Preparação dos esplenócitos

Para o isolamento dos esplenócitos, os baços foram assepticamente obtidos no final do experimento. Após a ruptura do baço entre lâminas de vidro em RPMI 1640 (Hyclone) com 1% FBS e 1% penicilina-estreptomicina, as células foram filtradas através de um filtro de células de 70-μm. Após a centrifugação, os glóbulos vermelhos foram lisados usando tampão de lisagem BD PharmLyse (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA). As células foram ressuspendidas em RPMI 1640 com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina e contadas usando um contador de células T20.

2,6. Injeção intraperitoneal de LPS

Ratos foram injetados intraperitonealmente com 1,3 mg/kg de LPS (sorotipo 055:B5, Sigma) no final do experimento. Após 1 h, os camundongos foram anestesiados com éter e o sangue foi coletado por punção cardíaca. O soro foi obtido e armazenado a -20°C até a análise.

2,7. Cultura celular

Células de exsudado peritoneal foram banhadas em pratos de 6 poços ou pratos de 60 mm e incubadas durante a noite a 37°C. Após a remoção das células não aderentes, as células ligadas foram estimuladas com 100 ng/ml de LPS durante 24 h. O sobrenadante e as células foram coletadas para os ensaios subsequentes. Os esplenócitos foram plaqueados em placas de 24 poços e estimulados com 2 μg/ml de anticorpo anti-CD3 (BD Biosciences) durante 48 h. O sobrenadante foi recolhido para análise de citocinas.

2.8. Citometria de fluxo

Células foram lavadas duas vezes em tampão fosfato salino (PBS) e ressuspendidas a 1 × 106 células/ml em tampão FACS (PBS/0,1% NaN3/1% FBS). As células foram bloqueadas com anticorpo anti-rato CD16/CD32 (BD Biosciences) a 4°C durante 5 min e depois coradas com anti-rato conjugado com fluoresceína SR-AI, anti-rato conjugado com PE LOX1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), anti-rato conjugado com PE CD36, CD11b conjugado com FITC, anti-CD11b conjugado com PE, CD86 conjugado com PE, CD4 conjugado com FITC, CD8a conjugado com PE, CD19 conjugado com FITC e CD19 conjugado com FITC (BD Biosciências) (todos os anticorpos foram diluídos 1:100) durante 30 min. no gelo no escuro. Foram usados anticorpos de isotipo combinados para mostrar ligação não específica. As células foram lavadas e ressuspendidas em tampão FACS. Um total de 10.000 eventos foram adquiridos em um citômetro de fluxo Navios (Beckman Coulter, La Brea, CA, EUA), e os dados foram processados usando o software Kaluza (Beckman Coulter).

2.9. Cytokine Analysis

Os níveis de TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-4 em sobrenadantes e soros foram determinados usando conjuntos ELISA de mouse BD OptEIA (BD Biosciences) de acordo com o protocolo do fabricante.

2.10. Ensaio de Proliferação

Esplenócitos (4 × 105) em placas de 96 poços foram estimulados com anti-CD3 mAb solúvel (2 μg/ml) para 48 h. A proliferação celular foi determinada usando o kit de ensaio CellTiter96 One Solution Cell Proliferation (Promega, Madison, WI, EUA).

2.11. Isolamento do RNA e PCR em Tempo Real

Total RNA foi isolado usando um Kit de Purificação do RNA Total FavorPrep (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan), e cDNA foi transcrito de forma reversa usando um kit de RNA para cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O cDNA diluído foi misturado com Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) e 2 pmol de primers específicos para iNOS, COX2, ou GAPDH. A amplificação do cDNA foi realizada usando um sistema de PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems). Após a desnaturação térmica inicial a 95°C durante 10 min, as condições PCR foram definidas a 95°C durante 15 seg e 60°C durante 1 min durante 40 ciclos. Para cada PCR, foi incluída como controlo negativo uma amostra correspondente de mRNA sem transcrição reversa. A quantificação do número de cópia de cDNA foi obtida usando uma curva padrão.

2,12. Análise estatística

Dados foram apresentados como erro padrão médio da média (SEM). O teste t de Student de duas faces ou análise de variância bidirecional foi aplicado para comparar diferenças entre grupos. Se a análise estatística mostrou que as diferenças entre grupos múltiplos foram significativas, o teste pós-hoc de Tukey foi utilizado para posterior comparação. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software IBM SPSS versão 22.0 (IBM, Chicago, IL, EUA). Valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

3. Resultados

3,1. Conteúdo de Atractylenolide I e Atractylenolide III em AME

entre os marcadores de controle de qualidade conhecidos, atractylenolide I e atractylenolide III são compostos anti-inflamatórios verificados in vitro . A fração de acetato etílico da AME foi provisoriamente identificada usando uma entrada pontiaguda de padrões autênticos com comparação de tempos de retenção e padrões espectrais visíveis aos raios UV. Os cromatogramas de HPLC são mostrados na Figura 1. O conteúdo de atractilenolida I e atractilenolida III na AME foi de 0,0338 mg/g de extrato e 0,565 mg/g de extrato, respectivamente.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 1

HPLC cromatogramas de Atractylodes macrocephala extracto de água (AME). (a, b) Marcadores padrão. (c, d) AME.

3.2. Efeito da Administração Oral da AME na Expressão do Receptor de Aspiradores nas Células do Exsudado Peritoneal do Rato

Injeção intraperitoneal de tioglicolato é comumente usada para induzir peritonite estéril e enriquecer macrófagos peritoneais de ratos em laboratórios . A maioria dos macrófagos peritoneais é derivada de monócitos sanguíneos . Recolhemos células exsudadas peritoneais de ratos tratados com AME usando este método. O CD11b foi usado como marcador para os macrófagos. Receptores necrófagos como SRA, CD36, e LOX-1 são upregulados durante a diferenciação entre monócitos e macrófagos; portanto examinamos a expressão destas proteínas. SRA, CD36, e LOX-1 foram quase exclusivamente expressos em células CD11b(+) (Figuras 2(a)-2(c)). A porcentagem de células SRA(+)CD11b(+) no grupo controle foi de 66%, e o tratamento com 500 mg/kg e 2.500 mg/kg de AME aumentou significativamente esta população para 69% e 76%, respectivamente. As frequências das populações de células CD36(+)CD11b(+) e LOX-1(+)CD11b(+) no grupo controle foram de 95% e 14%, respectivamente, e a EMA não induziu alterações significativas em ambas as populações. O aumento da população celular de SRA(+)CD11b(+) indica que a EMA pode estimular a diferenciação dos monócitos sanguíneos em macrófagos, em resposta ao tioglicolato.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 2

>

>Receptores de exsudato peritoneal expressos por células de exsudato peritoneal após administração oral de AME. Ratos receberam AME por via oral (500 ou 2500 mg/kg) durante 10 dias. As células do exsudato peritoneal foram isoladas de camundongos tioglicolato injetados e duplamente manchadas com anti-SRA conjugado com FITC e anti-CD11b Abs (a), anti-CD11b conjugado com FITC e anti-CD36 Abs (b), ou anti-CD11b conjugado com FITC e anti-LOX-1 Abs conjugado com PE (c). As células foram analisadas utilizando citometria de fluxo e são mostradas parcelas representativas de pontos. (d) As barras representam a média ± SEM (n=6). P <0,05, P<0,005 versus controle.

3,3. Efeito da Administração Oral de AME na Expressão de Superfície CD86 em Macrófagos Estimulados por LPS

Moléculas Estimuladoras como CD86 em macrófagos são necessárias para fortalecer a crosstalk entre macrófagos e células Th . Macrófagos peritoneais isolados de ratos tratados com AME foram estimulados com LPS por 24 h e a expressão da membrana do CD86 foi medida usando citometria de fluxo. A estimulação com LPS aumentou a intensidade média de fluorescência do CD86 de 5,24 para 11,24 (Figura 3). A intensidade média de fluorescência de CD86 nos grupos 500 e 2.500 mg/kg diminuiu significativamente para 10,14 e 10,59, respectivamente. Esses resultados indicam que a EMA pode afetar a interação entre macrófagos e células Th.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

Efeito da AME na expressão superficial das moléculas co-estimulatórias em LPS-macrófagos estimulados. Macrófagos peritoneais isolados dos grupos controle e EMA foram estimulados com 100 ng/ml de LPS durante 24 h e depois corados com anticorpo anti-CD86 conjugado com PE. (a) São mostrados histogramas representativos. (b) As barras representam a média ± SEM (n=6). (-): sem LPS, (+): Tratamento com LPS. IFM: intensidade de fluorescência média. # P<0,005 versus controle (-), P<0,05 versus controle (+).

3,4. Efeitos da Administração Oral da EMA na Resposta Inflamatória da Citocina em Macrófagos e Soro

Primeiro examinamos se a administração oral da EMA afeta a resposta inflamatória dos macrófagos. Macrófagos peritoneais do grupo controle ou em altas doses de EMC foram estimulados com LPS por 24 h e a produção de TNF-α e IL-6 no sobrenadante foi medida. Não houve diferença no nível de secreção de TNF-α entre os grupos controle e EMA, mas o nível de IL-6 foi aumentado no grupo EMA (Figura 4(a)). Também não houve alteração da expressão dos genes iNOS e COX-2 nas células estimuladas com LPS (Figura 4(b)). Em seguida, examinamos a resposta sistêmica de camundongos tratados com EMC à estimulação intraperitoneal por LPS. AME diminuiu os níveis séricos de TNF-α e IL-6 em 20% e 47%, respectivamente (Figura 5). Esses achados indicam que a atividade antiinflamatória da EMA pode ocorrer independentemente da modulação dos macrófagos.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 4

Efeito da EMA em citocinas e enzimas inflamatórias em LPS-macrófagos estimulados. Macrófagos isolados do grupo controle ou AME (2500 mg/kg) foram estimulados com LPS (100 ng/ml) por 24 h. (a) Os níveis de fator de necrose tumoral – (TNF-) α e interleucina- (IL-) 6 em sobrenadante foram determinados pelo ELISA. (b) A PCR quantitativa foi utilizada para medir a expressão dos genes iNOS e COX-2. A expressão do gene alvo foi normalizada para a expressão GAPDH. Os dados representam a média ± SEM (n=6). (-): sem LPS, (+): Tratamento com LPS. # P<0,005 versus controle (-), P<0,05 versus controle (+).

>

Figura 5

> Efeitos da administração oral de EMA sobre as respostas inflamatórias séricas após injeção intraperitoneal de LPS. AME (2500 mg/kg) foi administrada oralmente em camundongos durante 10 dias. O soro foi obtido 1 h após a injeção intraperitoneal de LPS (1,3 mg/kg) e os níveis séricos de TNF-α e IL-6 foram determinados por ELISA. Os dados representam a média ± SEM (n=10). (-): sem LPS, (+): tratamento com LPS. # P<0,001 versus controle (-), P<0,05, P<0,001 versus controle (+).

3,5. Efeitos da Administração Oral de EMA nas Populações de Células T esplênicas e Células B e Expressão MHC II

Para determinar se a administração oral de EMA altera as células imunes adaptativas, analisamos as porcentagens de células T esplênicas CD4 e CD8 e células B nos grupos controle e EMA. A população de células T CD4(+) aumentou significativamente de 23,4% para 27,2% e 26,9% nos grupos 500 e 2.500 mg/kg, respectivamente (Figuras 6(a) e 6(d)). Não foram observadas diferenças nas populações de células T CD8 e de células B (Figuras 6(a), 6(b), e 6(d)). Moléculas MHC classe II são necessárias para a apresentação de antígenos às células CD4 T. Analisamos a expressão esplênica das moléculas de MHC classe II do rato IA/IE e constatamos que a intensidade média de fluorescência das moléculas de MHC II aumentou significativamente de 65,3 para 68,9 no grupo de 2.500 mg/kg de AME (Figuras 6(c) e 6(e)). Estes achados sugerem que a EMA induz alterações no sistema imunológico adaptativo.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figura 6

Efeitos da administração oral da EMA na composição do sistema imunitário adaptativo do baço. Os esplenócitos foram isolados dos grupos controle ou de EMA e duplamente manchados com anticorpo anti-CD4 conjugado com FITC e anticorpo anti-CD8 conjugado com PE (a), anticorpo anti-CD19 conjugado com FITC (b), ou anticorpo anti-MHC II conjugado com FITC (c) e avaliados usando citometria de fluxo. (a-c) São mostrados os pontos ou histogramas representativos. (d-e) As barras representam a média±SEM (n=6). P <0,001 versus controle.

3,6. Efeitos da Administração Oral da EMA na Proliferação de Células T e Resposta à Citoquina Th1/Th2 em Esplenócitos

Nós investigamos a função das células T esplênicas após o tratamento da EMA. Os esplenócitos isolados dos grupos controle ou EMA foram estimulados com anticorpos anti-CD3, um mitógeno que ativa toda a população de células T independentemente da especificidade do receptor de antígeno. Tratamento com anticorpo anti-CD3 para 48 h de densidade óptica aumentada 2,6 vezes, conforme medido pelo ensaio MTS. Não houve diferença na proliferação induzida pelo anticorpo anti-CD3 entre os grupos controle e EMA (Figura 7(a)). IFN-γ e IL-4 são citocinas representativas para células Th1 e Th2, respectivamente. Avaliamos a secreção de IFN-γ e IL-4 em esplenócitos estimulados com o anticorpo anti-CD3. Uma redução significativa na secreção de IFN-γ foi observada no grupo 500 mg/kg de AME, enquanto a secreção de IL-4 foi significativamente aumentada no grupo 2.500 mg/kg (Figura 7(b)). Embora nenhum efeito dose-dependente tenha sido observado, a EMA tendeu a promover a resposta Th2.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 7

Efeitos da EMA na proliferação e secreção de citocinas de células T esplênicas ativadas. Os esplenócitos isolados dos grupos controle e EMA foram cultivados e estimulados com anticorpos anti-CD3 (2 μg/ml) durante 48 h. (a) A resposta proliferativa dos esplenócitos foi determinada usando o ensaio MTS. (b) A secreção de citocinas às 48 h de estimulação foi medida por ELISA. As barras representam a média±SEM (n=6). (-): sem anticorpos anti-CD3, (+): tratamento com anticorpos anti-CD3. # P <0,001 versus controlo (-), P <0,05 versus controlo (+).

4. Discussão

Na medicina tradicional chinesa, espera-se que as ervas Qi boosting melhorem o sistema imunitário. Neste estudo, nós focamos especificamente nas respostas inflamatórias de macrófagos e células T isoladas de camundongos que receberam AME por via oral.

Peritonite estéril induzida por tioglicolato foi introduzida pela primeira vez em 1964 por Gallily et al. e desde então tem sido o método mais comumente usado para o isolamento de macrófagos primários. No quarto dia após a injeção intraperitoneal de tioglicolato, o número total de células de exsudato peritoneal aumenta aproximadamente 5 vezes. Entre essas células, os macrófagos são o tipo celular predominante, seguido pelos eosinófilos . A fonte do aumento do número de macrófagos peritoneais em ratos infectados com tioglicolato é a medula óssea derivada de monócitos sanguíneos. A upregulação dos receptores do necrófago ocorre durante o processo de diferenciação entre monócitos e macrófagos. Os receptores necrófagos, um tipo de receptores inatos de macrófagos, são responsáveis pela fagocitose e reconhecem especificamente os ligandos polianiônicos . Usamos o CD11b e vários marcadores de receptores de necrófagos para identificar macrófagos derivados de monócitos em células exsudadas peritoneais e descobrimos que a população de células CD11b(+)SRA(+) foi significativamente aumentada no grupo AME. Isto sugere que a administração de EMA promove o recrutamento e diferenciação de monócitos sanguíneos para macrófagos em resposta ao tioglicolato.

LPS é reconhecido pelo receptor de toll-like (TLR)-4/MD-2 complexo. O TLR4 induz respostas inflamatórias através de duas moléculas adaptadoras, MyD88 e TRIF . A via de sinalização dependente de MyD88 ativa a NF-κB e a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) para induzir genes inflamatórios como TNF-α e IL-6 . A via de sinalização dependente do TRIF ativa o fator regulador de interferon-3 para produzir IFN-β, que é necessário para a upregulação de moléculas co-estimuladoras. O caminho de sinalização TRIF também participa da ativação de NF-κB e MAPK, mas de forma atrasada em relação ao caminho dependente de MyD88 . A upregulação de moléculas costimulatórias é exclusivamente dependente do TRIF, enquanto as respostas inflamatórias são co-dependentes do MyD88 e do TRIF . Não houve efeito inibitório sobre os marcadores inflamatórios testados em macrófagos do grupo AME. Ao invés disso, a expressão CD86 foi diminuída. O CD86 em macrófagos liga o CD28 em células Th para fortalecer a atividade das células Th . Nossos resultados indicam que a administração oral de EMA não afeta as respostas inflamatórias dependentes de NF-κB- e MAPK em macrófagos, mas interfere especificamente no caminho TRIF-dependente que leva à expressão de CD86 apenas. Estudos adicionais são necessários para avaliar se a EMA causa alterações em uma situação patológica onde macrófagos e células Th predominam.

O sistema de macrófagos estimulados por LPS é um modelo in vitro muito comum para avaliar a atividade antiinflamatória de produtos naturais ou candidatos a medicamentos. Usando este modelo, é fácil obter o resultado desejado com componentes lipossolúveis, pois eles podem facilmente penetrar na membrana celular. Nossos dados mostraram que macrófagos peritoneais isolados de ratos aos quais foi dada AME oralmente não mostraram efeitos anti-inflamatórios ex vivo, contradizendo resultados previamente relatados in vitro . Em contraste, a atividade antiinflamatória da EMA foi observada na resposta sérica de TNF-α e IL-6 na injeção intraperitoneal de LPS. Esta atividade antiinflamatória sistêmica é menos provável de ser mediada pela modulação de macrófagos. Uma das diferenças entre as condições in vivo e in vitro é que o LPS é transportado na circulação por várias lipoproteínas e depois liberado por hepatócitos in vivo, enquanto que este evento não pode ser imitado in vitro. A depuração do LPS pode evitar a sobre-estimulação dos macrófagos hepáticos. Se a atividade anti-inflamatória sistêmica da EMA está relacionada com a depuração do LPS no fígado ainda está por determinar. Um resultado similar foi obtido em macrófagos peritoneais isolados de camundongos com extrato de água oral do Astragalus membranaceus (dados não publicados). Astragalus membranaceus e AM pertencem à mesma categoria de erva Qi-tonificante. Neste momento, não sabemos se a actividade anti-inflamatória in vivo que não envolve modulação de macrófagos é única para estas plantas medicinais ou uma propriedade comum induzível por plantas medicinais Qi-tonificantes, e precisamos de acumular mais dados para tirar quaisquer conclusões. Além disso, Li et al. relataram que o atractylenolide I e 14-acetoxi-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, um tipo de composto poliacetilênico isolado do AM, tem uma estrutura molecular que interage com o receptor glucocorticóide ligado à membrana. De acordo com seu estudo, 300 mg/kg de atractylenolide I oral e 30 mg/kg de poliacetileno oral foram as doses mínimas necessárias para mostrar efeitos anti-inflamatórios . A quantidade de atractylenolide I em 2.500 mg/kg de AME é de apenas 0,097 mg/kg, uma dose muito abaixo do mínimo necessário. Além disso, a perda de poliacetilenos deve ter ocorrido durante a preparação da EMA. É possível que a EMA contenha compostos semelhantes a glucocorticóides não identificados que contribuem para sua atividade antiinflamatória sistêmica.

Um número suficiente de células T é necessário para manter uma resposta imune adequada. Em condições normais, o número total de células T é mantido pela geração de células T ingênuas no timo e pela rotação das células T periféricas ingênuas e células T de memória. Ratos e seres humanos sofrem atrofia do timo com a idade e, consequentemente, a produção de células T ingénuas diminui em ambas as espécies. No entanto, em termos de manutenção das células T ingénuas, os ratos produzem células T ingénuas durante a sua vida, enquanto que os humanos adultos mantêm esta população por divisão periférica das células T ingénuas. Além disso, o tempo de vida das células T naïves do rato é 40 vezes mais curto do que o dos seus homólogos humanos . As células T de memória são mantidas por divisão intermitente . O mecanismo preciso de sobrevivência e de proliferação homeostática das células T ingênuas e de memória não está completamente definido, mas envolve sinais do complexo TCR/MHC e citocinas, como IL-7 e IL-15 . O efeito prolongado das vacinas depende das células T de memória, enquanto que o tratamento de condições linfopênicas requer células T ingênuas. Nós não determinamos se a população de células T esplênicas CD4 que aumentou com o tratamento de EMA consistia de células T CD4 naïve ou células T CD4 de memória. Uma caracterização detalhada da fração celular que responde à EMA ajudará a especificar qual situação é mais adequada para a aplicação da EMA.

De notar que a upregulação simultânea de moléculas MHC classe II no baço ocorreu no grupo da EMA. As moléculas de MHC classe II são necessárias para fornecer antígenos às células CD4 T. Descobrimos rotineiramente que a maioria das células MHC classe II que expressam células no baço são células B e as células restantes são macrófagos e células dendríticas. Não esclarecemos que tipos de células mostraram upregulação de moléculas de MHC classe II após a administração de MHC. No entanto, os aumentos no número de células CD4 T e na expressão da molécula MHC classe II no baço indicam que a suplementação da MHC contribui para a manutenção sistêmica das células CD4 T. O papel da IL-4 sob condições fisiológicas é melhorar a resposta de anticorpos promovendo a sobrevivência e proliferação de células B e fornecer defesa contra a infecção por helmintos. Os esplenócitos dos grupos da EMA mostraram um aumento da produção de IL-4 durante a ativação das células T ex vivo concomitante com a diminuição da produção de IFN-γ. Estes resultados sugerem que em condições normais a EMA promove a resposta Th2. Em contraste, a administração oral de glicoproteína derivada da AM promove a resposta Th1 enquanto diminui a resposta Th2 em um modelo alérgico . Não está claro se este composto representa toda a actividade da AM. Mais estudos são necessários para determinar se a EMA previne ou agrava as respostas patológicas Th2.

5. Conclusão

Neste estudo, observamos mudanças nas respostas de macrófagos e células T em ratos normais após a administração oral da EMA. AME aumentou a diferenciação de monócitos induzidos por tioglicolato no peritônio e suprimiu os níveis de TNF-α e IL-6 induzidos por LPS no soro. Ao contrário desses efeitos antiinflamatórios sistêmicos, os efeitos antiinflamatórios não foram evidentes em macrófagos isolados do grupo da EMA, exceto por alterações na expressão de moléculas costimulatórias. AME também influenciou o sistema imune adaptativo, aumentando o número de células CD4 T e a expressão de moléculas MHC classe II e promovendo a resposta Th2 sobre a resposta Th1.

A abreviações

AM:	Atractylodes macrocephala Koidz
AME:	AM water extract
LPS:	Lipopolissacarídeo
TNF-α:	Fator de necrose tumoral-α
IL:	Interleucina
APC:	Antigénio apresentando célula
TCR:	T receptor de célula
MHC:	Major complexo de histocompatibilidade
Télula:	Célula auxiliar de T
DW:	Água desionizada
FBS:	Soro bovino fetal
PBS:	Fosfato salino tamponado
iNOS:	Óxido nítrico sintase induzível
COX-2:	Cicloxigenase-2
TLR:	Toll-like receptor
IFN-γ:	Interferon-γ
MAPK:	Mitogen-activated protein kinase.

Dados Disponibilidade

Os dados utilizados para suportar os resultados deste estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação.

Conflitos de interesse

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Conhecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciências Básicas através da National Research Foundation of Korea financiada pelo Ministério da Educação (2014R1A1A2055052).