Ensaio clonogénico: o quê, porquê e como

Um ensaio clonogénico, também conhecido como ensaio de formação de colónias

é um ensaio de sobrevivência celular in vitro. Este ensaio foi inicialmente descrito na década de 1950, onde foi utilizado para estudar os efeitos da radiação na sobrevivência e crescimento das células cancerígenas, tendo posteriormente desempenhado um papel essencial na radiobiologia.2

Para medir a clonogenicidade, as células precisam ser semeadas a densidades muito baixas e deixadas por um período de 1-3 semanas para que as colônias se formem. As colônias são então fixadas, coradas com violeta cristalina para torná-las visíveis, e contadas. As curvas de sobrevivência das células são traçadas para analisar os dados. Hoje, os ensaios clonogénicos são utilizados para responder a uma variedade de questões experimentais, especialmente em biologia do cancro.

Destaques deste blog:

Como realizar um ensaio clonogênico com considerações importantes a serem feitas ao longo do caminho

Usando a microscopia sem rótulo e a detecção de confluência para avaliar a contagem e o tamanho das colônias utilizando a quantificação automatizada de imagens

O ensaio de sobrevivência clonogênica

Os ensaios clonogênicos são amplamente utilizados no campo da pesquisa do câncer, uma vez que a formação de clones é interpretada como um traço de células cancerígenas com capacidade de iniciar tumores. Embora este ensaio tenha sido inicialmente utilizado no campo da radiobiologia, tornou-se uma ferramenta padrão na pesquisa do câncer para avaliar o crescimento celular e os efeitos citotóxicos ou genotóxicos de vários agentes com potencial aplicação clínica. Isto inclui agentes quimioterápicos e terapias específicas por si só ou em combinação 3,

Crescimento clonogénico também é utilizado para avaliar a estaminaisidade de determinadas populações de células, uma vez que as células estaminais são células de longa duração com potencial de proliferação contínua. Isto é particularmente relevante para a investigação do cancro, uma vez que as células estaminais cancerosas estão frequentemente associadas à quimiorresistência, à formação de tumores secundários e à recidiva do cancro. Portanto, a investigação da carcinogenia utilizando um ensaio clonogénico é uma ferramenta valiosa e amplamente utilizada para prever a eficácia de uma determinada terapia.4

Os ensaios clonogénicos medem a capacidade das células para reter a sua integridade reprodutiva durante um período prolongado de tempo. Esta é uma característica importante, pois revela efeitos fenotípicos que requerem tempo e possivelmente várias divisões celulares para se desenvolverem. Quando se analisa a resistência terapêutica, isto é particularmente importante. A resistência às drogas não pode ser identificada através de ensaios de citotoxicidade a curto prazo.5

Como realizar um ensaio clonogénico

A informação nesta secção é adaptada de Franken et al. (2006) que publicaram um protocolo de ensaio clonogénico nos Protocolos da Natureza1, combinado com alguns insights da minha própria experiência adquirida ao realizar mais de 60 ensaios clonogénicos durante o meu doutoramento.

Essencialmente, existem duas formas diferentes de realizar um ensaio clonogénico:

(1) As células podem ser semeadas a baixas densidades e depois tratadas para examinar o efeito do tratamento sobre a clonogenicidade das células.

(2) As células podem ser tratadas durante um período específico e depois novamente semeadas a baixas densidades em meios livres de tratamento para testar a capacidade clonogénica.

Este último é frequentemente utilizado para avaliar a resistência terapêutica após o tratamento. A Figura 1 resume a primeira abordagem que é o método tradicional para realizar um ensaio clonogênico. Como ficará claro, este é um método demorado que não fornece nenhuma informação sobre a progressão do experimento (apenas o desfecho). Discutiremos mais tarde métodos alternativos automatizados e não endpoint.

Protocolo tradicional para ensaios clonogênicos

Figure. 1 | Um resumo de um protocolo clonogênico tradicional onde as células são semeadas, tratadas e então a clonogenicidade avaliada.

Os ensaios clonogênicos são tipicamente realizados em placas de 6 poços ou 24 poços. As células precisam de ser escassamente e uniformemente revestidas para que se possam formar colónias isoladas. Portanto, é importante otimizar sua densidade de semeadura para o tamanho do poço escolhido antes de realizar seu ensaio clonogênico.

Um bom ponto de partida é procurar na literatura para ver se algum estudo realizou ensaios clonogénicos com a sua linha celular e depois testar esta densidade de semeadura e mais duas ou três outras. Durante este processo de otimização, também é importante considerar seu ponto final experimental (por exemplo, 7 dias, 14 dias ou 21 dias) e a taxa de crescimento celular, pois você não quer fundir colônias, o que irá interferir na quantificação e análise das colônias. As densidades de semeadura devem ser as mesmas para todas as condições de tratamento dentro do seu experimento.
Usar os controles certos é crítico para a fase de análise. Deve-se sempre usar um controle sem tratamento, assim como um controle somente de veículos (pode ser DMSO, PBS, ou qualquer solvente em que seu tratamento esteja dissolvido). Para condições de tratamento, uma série de diluições é frequentemente utilizada. O período de tratamento e a dureza do seu tratamento ajudarão a determinar a sua faixa de concentração – isto provavelmente requer alguma otimização. Cada condição de controlo e experimental deve ser realizada em triplicado.

Durante a fase de formação da colónia terá de monitorizar o crescimento da colónia em todas as condições de tratamento. Uma colónia é considerada como sendo de 50 células ou mais e elas só são visíveis ao microscópio. Como este ensaio é normalmente de longa duração, será necessário mudar o meio celular. As células estarão em uma confluência muito baixa para começar, então você não precisará mudar o meio de cultura tão regularmente quanto o normal. No entanto, se você estiver semeando e depois tratando com um medicamento ou composto, é importante considerar sua meia-vida e adicionar um novo tratamento conforme necessário.

Para investigadores que estejam interessados em imaginar o crescimento da colónia ao longo do tempo. Recomendamos olhar para o CytoSMART Omni.

—————–

São muitas vezes as colónias sob as condições de controlo que crescem mais rapidamente e por isso pode usar estas células como indicação do seu ponto final experimental, ou seja, terminar a experiência antes das suas colónias começarem a fundir-se e se isto acontecer demasiado depressa, use uma densidade de sementeira mais baixa para a sua experiência. É importante terminar o experimento para todas as condições de tratamento ao mesmo tempo.

Após ter atingido o seu ponto final experimental, as células precisam ser lavadas suavemente com PBS (adicione a PBS ao lado do poço para não perturbar as colónias), fixadas, e coradas com o corante de intercalação de DNA, violeta cristal (0,5% p/v) durante pelo menos 30 minutos. A remoção da mancha em excesso pode ser confusa. A melhor técnica é mergulhar suavemente as placas em copos imersos em água até que todo o excesso de mancha tenha sido removido e você só fique com as colônias roxas brilhantes. As colónias manchadas podem ser contadas até 50 semanas após a coloração. Tire fotos de alta resolução de seus poços para usar em análises, apresentações e figuras de publicação.

Para apoiar os pesquisadores na análise e otimização de seus ensaios de formação de colônias, CytoSMART introduziu uma aplicação para o CytoSMART Omni para detectar colônias em imagens (time-lapse) de placas de poços inteiras com ampliação de 10X. Na incubadora, a imagem em time-lapse pode fornecer informação cinética em vez do ponto final, que pode fornecer informação mais detalhada sobre quando o tratamento começa a afectar as células. A análise de imagem sem rótulo é utilizada para detectar colónias, avaliar o seu tamanho e circularidade. A análise de imagem sem rótulo é usada para detectar colónias, avaliar o seu tamanho e circularidade.

Como analisar o seu ensaio clonogénico

É realmente tão simples como contar manualmente as suas colónias para cada condição de tratamento e representar os dados como uma curva de sobrevivência (deve utilizar pelo menos três repetições biológicas para a sua curva).

Uma curva de sobrevivência requer que a fração de sobrevivência (SF) das células tratadas (isto inclui uma razão entre as colônias formadas e as células semeadas) seja calculada e plotada contra a dose de tratamento. Antes de você poder calcular a SF, a eficiência de revestimento (PE) de suas células precisa ser determinada como diferentes linhas de células têm diferentes eficiências de revestimento e isto afeta o cálculo da fração de sobrevivência.

PE é a razão entre o número de colónias e o número de células semeadas nas suas células não tratadas1. A figura 1 mostra as fórmulas PE e SF e um exemplo de curva de sobrevivência.

A contagem manual de colônias é cansativa e pode ser propensa a enviesamento, por isso uma série de ferramentas informatizadas de análise de imagens livremente disponíveis foram desenvolvidas para analisar imagens de ensaio clonogênico de forma rápida e objetiva. Uma menção digna de nota é o pacote de software livremente disponível desenvolvido por Brzozowska et al. (2019) que não só conta as colónias, mas também traça as suas distribuições de tamanho que é outra camada de informação útil do comportamento celular (ver figura 2a).6

Uma alternativa à contagem e quantificação de colónias individuais, é determinar a percentagem da área do poço que é coberta pelas colónias (percentagem da área da colónia) para quantificar o crescimento das células clonogénicas. Guzmán et al. (2014) desenvolveram um plugin ImageJ livremente disponível chamado ColonyArea que faz exatamente isto (ver figura 2b).7 Esta é uma ferramenta útil para usar se você tiver colônias fundidas que são difíceis de contar a olho nu ou por software de contagem de colônias ou se você quiser um método de análise rápida e de alto rendimento.

Figure. 2 | Ferramentas de medição de ensaios clonogénicos disponíveis livremente. (A) Brzozowska et al. desenvolveram um software (countPHICS) que conta colônias e mede o tamanho das colônias.6 (B) Guzmán et al. desenvolveram um plugin ImageJ, ColonyArea, que quantifica a área de crescimento das colônias e a intensidade de coloração.7

Protocolo de ensaio clonogênico sem etiquetas, semidiautomatizado e semidiautomatizado

Um trabalho recente de Mayr et al. (2018), descreve um novo e modificado protocolo de ensaio clonogênico que utiliza um formato de 96 placas de micropoços e detecção de confluência para medir colônias. Este método permite configurações experimentais abrangentes utilizando uma placa de 96 poços, é livre de etiquetas, não tem ponto final de coloração e a análise é semi-automática (figura 3)8. Além disso, a medição de confluência não endpoint, resolvida no tempo, do mesmo poço mostrou que a análise semi-automática era adequada para determinar o número de colónias e o tamanho médio.

Figure. 3 | Mayr et al. avaliaram o crescimento clonogênico no formato de 96 poços ao longo do tempo utilizando a detecção de confluência8. O gráfico mostra a quantificação do crescimento clonogênico em diferentes timepoints e as imagens mostram poços específicos com detecção de confluência. As manchas verdes representam áreas detectadas por um leitor de confluência e as setas laranja indicam colônias fundidas.

Este método de ensaio clonogênico fornece uma alternativa de tempo e custo efetivo para o protocolo de ensaio clonogênico padrão. Sem necessidade de fixação do ponto final e coloração, este protocolo permite o monitoramento e análise contínua do crescimento clonogênico. Além disso, métricas adicionais sobre a cinética do crescimento das colônias também podem ser extraídas durante o experimento. O formato miniaturizado também abre a oportunidade de testar tratamentos caros, tais como terapias baseadas em siRNA ou CRISPR/Cas9, que não seriam viáveis com o volume de tratamento necessário para uma placa de 6 ou 24 poços. Por fim, Mayr et al. demonstraram que a microscopia sem rótulo com detecção de confluência é uma opção robusta e viável para medir a clonogenicidade.

Uma solução sem rótulo, não endpoint e automática para os seus ensaios clonogénicos é o CytoSMART Omni com o seu algoritmo de detecção de colónias. A formação de colónias é medida ao longo do tempo ao longo de todo um poço com a contagem de colónias, tamanho e leituras de circularidade. As suas células não têm de sair da incubadora e podem ser obtidas informações cinéticas celulares durante o processo de formação da colónia (figura. 4).

Figure 4 |Detecção automática de colónias utilizando o CytoSMART Omni. As células HEP-G2 de câncer de fígado em uma placa de 24 poços foram imersas durante 75 horas usando o CytoSMART Omni que é mantido dentro de uma incubadora padrão de CO2. A imagem mostra um poço cheio após o algoritmo de detecção da colónia ter sido executado com grupos de células destacadas pela máscara de colónia laranja. A contagem, tamanho e circularidade das colónias foram medidas ao longo da duração do ensaio e um mostrado nos gráficos.

Saiba mais sobre todas as soluções de imagem CytoSMART aqui