A fim de demonstrar o uso do Escher-FBA para aplicações reais, apresentamos quatro exemplos chave de FBA que podem ser executados diretamente no navegador. Estes são adaptados a partir de uma revisão do FBA e suas aplicações . Estes exemplos se baseiam no modelo de núcleo padrão do E. coli, por isso estão prontos para serem implementados assim que a página web do Escher-FBA for aberta. Certifique-se de clicar no botão Reset Map entre cada exemplo. Se você estiver tendo problemas para encontrar uma reação, simplesmente clique na opção Procurar no menu Exibir (ou na tecla “f” do seu teclado) para abrir uma barra de busca.
FBA com substratos de carbono alternativos
O primeiro exemplo demonstra o uso de FBA para prever se o crescimento pode ocorrer em substratos de carbono alternativos. O modelo de núcleo padrão da E. coli inclui um meio mínimo simulado com D-glucose como a fonte de carbono. Aqui, vamos mudar a fonte de carbono de D-glucose para succinato. Primeiro, passe o mouse sobre a reação de troca de succinato EX_succ_e, e mude o limite inferior para – 10 mmol/gDW/hr., arrastando o controle deslizante ou entrando – 10 no campo do limite inferior. Em seguida, passe o mouse sobre a reação de troca de D-glucose EX_glc_e, e aumente o limite inferior para 0 ou clique no botão Knockout. O objetivo padrão ainda é maximizar o crescimento, portanto estas duas mudanças instruirão o programa a calcular a taxa máxima de crescimento enquanto usa succinato como fonte de carbono em vez de D-glucose. Você deve ver que a taxa máxima de crescimento prevista diminui de 0,874 h- 1 para 0,398 h- 1, refletindo o menor rendimento de crescimento de E. coli em succinato (Fig. 2a). Esta é a abordagem geral para fazer alterações no Escher-FBA; passe o mouse sobre a reação, faça as alterações necessárias e o Escher-FBA exibirá automaticamente seus resultados. Os valores de limite inferior para a troca de fontes de carbono representam medidas experimentais, assim você pode tentar ajustar o valor de limite inferior específico para valores realísticos de crescimento em outras fontes de carbono.
Exemplos de simulações do Escher-FBA. (a) Crescimento simulado com succinato como única fonte de carbono. (b) Simulação de crescimento anaeróbico em um meio com o mínimo de glicose. (c) Maximização do rendimento do ATP no modelo padrão. (d) Crescimento do modelo iMM904 de S. cerevisiae. Note que as larguras das setas foram aumentadas no menu de configurações para tornar as alterações mais óbvias
FBA durante o crescimento anaeróbio
Crescimento anaeróbio pode ser simulado da mesma forma, ao se masturbar sobre a reação EX_o2_e e clicar em Knockout ou mudar o limite inferior para 0. Se você mudar a troca de oxigênio para zero enquanto o succinato ainda é a única fonte de carbono, o indicador Flux Through Objective exibe “Infeasible solution/Deadad cell”, o que significa que o crescimento não é possível. Tente clicar no botão Reset no canto inferior direito para simular um meio mínimo com D-glucose como fonte de carbono, depois nocaute EX_o2_e, e a taxa de crescimento prevista deve ser de 0,211 h- 1 (Fig. 2b).
FBA com objetivos compostos
Escher-FBA suporta a definição de objetivos múltiplos no modo Objetivos Compostos. No modelo padrão, a definição de uma nova objetiva sempre desabilita a objetiva anterior. Para ativar o modo, primeiro clique no botão Objetivos Compostos, na parte inferior da tela. Como exemplo de uso do modo: para verificar a taxa máxima de crescimento enquanto minimiza o fluxo através do SUCDi, comece com o objetivo padrão de maximizar a produção de biomassa. Em seguida, passe o mouse sobre a etiqueta de reação do SUCDi e clique no botão Minimizar dentro da ponta da ferramenta. No canto inferior direito, você deve ver os dois objetivos listados. Note que apenas os coeficientes objetivos de 1 ou – 1 (representados por Maximizar e Minimizar) são suportados atualmente. Para voltar a objetivos únicos, basta clicar novamente no botão Objetivos Compostos.
Análise dos rendimentos metabólicos
Tambem podemos usar Escher-FBA para determinar os rendimentos máximos de precursores e cofatores como o ATP. Tudo o que é necessário é uma reação estequiometricamente equilibrada que consome o co-fator de interesse. A reacção ATP Maintenance (ATPM) é um desses exemplos. Para determinar a produção máxima de ATP, basta passar o mouse sobre a reação ATPM e clicar no botão Maximizar. Configurar o objetivo desta forma funciona porque, para que o sistema maximize o fluxo através da reação ATPM, ele deve primeiro produzir ATP na maior quantidade possível. Quando o ATPM é maximizado no modelo padrão do metabolismo do núcleo da E. coli, o valor da objetiva é 175 mmol/gDW/hr. (Fig. 2c). Com succinato como fonte de carbono, este valor diminui para 82,5 mmol/gDW/hr. Este mesmo procedimento pode ser seguido para qualquer metabolito de interesse criando uma reação de consumo estequiometricamente equilibrada e ajustando o modelo para maximizar o fluxo através dessa reação. Note que atualmente não é possível criar tal reação automaticamente no Escher-FBA, mas isto pode ser adicionado a uma versão futura.
Análise da variabilidade do fluxo
Analisando soluções alternativas ótimas no metabolismo é outra aplicação útil do FBA . Como as soluções produzidas através do FBA são frequentemente não únicas, pode ser útil conhecer a gama de valores de fluxo que uma determinada reacção pode ter. A análise da variabilidade do fluxo (FVA) é frequentemente utilizada para calcular estas faixas em toda a rede . O Escher-FBA não suporta cálculos de FVA diretamente, mas é possível calculá-los para uma determinada reação. Para fazer isso, primeiro passe o mouse sobre a função objetivo (a reação biomassa Biomassa_Ecoli_core_w_GAM) e defina os limites superior e inferior para um pouco menos do que o valor do fluxo atual (no mapa padrão, tente 0,870). Em seguida, passe o mouse sobre uma reação de interesse e clique nos botões Maximizar e Minimizar para ver o fluxo máximo e mínimo através dessa reação, dada a taxa de crescimento ótima. Por exemplo, maximizar e minimizar o fluxo através do GAPD em glicólise produz uma faixa de fluxo viável de 15,44-16,68 mmol/gDW/hr., indicando que o fluxo glicolítico é altamente restrito a altas taxas de crescimento. Por outro lado, maximizando e minimizando o fluxo através do MALS no shunt de glioxilato produz uma faixa de fluxo viável de 0-2,64 mmol/gDW/hr., indicando que o shunt de glioxilato pode ser ativado ou inativo a altas taxas de crescimento. Este procedimento pode ser feito com qualquer conjunto de reações e o usuário pode restringir seu sistema a qualquer número de valores de fluxo para ver o intervalo de soluções disponíveis para uma determinada reação.
Usando outros modelos em escala de genoma
O modelo padrão E. coli core não é o único sistema que pode ser simulado. Por exemplo, se alguém desejar executar simulações em uma célula de levedura, um modelo e mapa para Saccharomyces cerevisiae pode ser baixado de http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. Nessa página, clique no botão de download do modelo (iMM904.json) e do mapa (iMM904.Central carbon metabolism.json). Carregue estes no Escher-FBA clicando em Load Map JSON no menu Map e Load Model JSON no menu Model para carregar ambos os arquivos JSON. Uma vez carregado, o mapa está pronto para editar e simular com qualquer uma das ferramentas no Escher ou Escher-FBA (Fig. 2d). Com um modelo maior como o iMM904, nem todas as reações serão visíveis ao mesmo tempo, mas você pode adicionar uma reação à visualização. Primeiro clique no ícone da chave inglesa na barra lateral ou selecione Adicionar modo de reação no menu Editar. Agora, as reações podem ser adicionadas clicando em qualquer lugar no mapa e selecionando a reação desejada no menu suspenso. O campo de entrada de texto pode ser usado para procurar por uma reação de interesse.
Aplicação do Escher-FBA ao projeto da fábrica de células microbianas
Para fornecer um exemplo de uma hipótese de pesquisa que pode ser testada usando Escher-FBA, carregamos modelos em escala de genoma de E. coli contendo duas rotas para produzir 1-propanol para produção química. Estas vias foram recentemente analisadas em um estudo sobre o poder preditivo de modelos em escala de genoma para a simulação de cepas reais de fábrica de células microbianas . O primeiro modelo inclui uma única rota para a produção de 1-propanol (arquivo adicional 1) relatado pela primeira vez por Atsumi et al. . O segundo modelo inclui duas vias sinérgicas para a produção de 1-propanol (arquivo adicional 2), primeiro relatado por Shen e Liao . Cada modelo pode ser carregado separadamente (com o Modelo > Load COBRA modelo JSON botão de menu), e um único mapa do metabolismo central é fornecido que é compatível com ambos os modelos (Arquivo adicional 3, pode ser carregado com Mapa > Load Map JSON).
Estávamos curiosos se a abordagem sinérgica para a produção de 1-propanol – que é conhecido por ter maior produção – também tem uma diferença no uso do caminho necessário. Portanto, nós carregamos cada modelo individualmente, maximizamos a excreção do 1-propanol (pairou sobre EX_1poh_e e clicou Maximize), definimos o limite inferior para excreção a 99% do máximo, então minimizamos o fluxo através do primeiro passo comprometido da via de fosfato pentose, glucose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH2r). Os mapas resultantes demonstram que as vias sinérgicas para a produção de 1-propanol estão estoquiometricamente equilibradas com a glicólise, pelo que não requerem actividade de PPP (Fig. 3b). Por outro lado, a via individual requer um fluxo de PPP significativo (Fig. 3a). Outras vias de uso, como o fluxo TCA necessário para cada caso, também podem ser exploradas nestes mapas.
O uso da via para duas vias heterólogas para a produção de 1-propanol em E. coli. O fluxo da via de fosfato pentose (PPP) necessário para cada via heteróloga de produção pode ser comparado, primeiro, forçando a produção de 1-propanol a ser 99% do valor máximo (estabelecendo o limite inferior da reação de troca do 1-propanol) e, segundo, minimizando o fluxo através da primeira etapa da PPP. (a) O caminho do 1-propanol relatado por Atsumi et al. utiliza um único caminho para atingir a produção de 1-propanol. Ele requer um fluxo PPP significativo e tem um rendimento global mais baixo. (b) O caminho reportado por Shen e Liao utiliza dois caminhos sinérgicos para alcançar um maior rendimento. O caminho é estequiometricamente equilibrado com glicólise, portanto não requer fluxo de PPP
Enquanto Escher-FBA já pode ser usado para muitas simulações de FBA diretamente no navegador web, vários dos exemplos apresentados por Orth et al. não podem ser realizados atualmente com Escher-FBA . A partir de agora, o Escher-FBA não pode realizar funções como a análise de gene knockout ou a análise de robustez. No entanto, Escher-FBA utiliza representações SVG flexíveis para elementos visuais, de modo que a análise de robustez e até mesmo características gráficas, como planos de fase, podem ser adicionadas. Estabelecemos um roteiro de desenvolvimento para Escher-FBA (disponível na página inicial https://sbrg.github.io/escher-fba) e um processo de desenvolvimento iterativo para eventualmente permitir a análise de biologia de sistemas complexos no navegador web.