Espectrometria de massa em tandem

Fragmentação de íons fase gasosa é essencial para a espectrometria de massa tandem e ocorre entre diferentes estágios da análise de massa. Há muitos métodos usados para fragmentar os íons e estes podem resultar em diferentes tipos de fragmentação e, portanto, diferentes informações sobre a estrutura e composição da molécula.

Fragmentação na fonteEditar

A maior parte das vezes, o processo de ionização é suficientemente violento para deixar os íons resultantes com energia interna suficiente para fragmentar dentro do espectrômetro de massa. Se os íons do produto persistirem em seu estado não-equilibrio por um período moderado de tempo antes da auto-dissociação, este processo é chamado de fragmentação metastable. A fragmentação do bocal refere-se à indução intencional da fragmentação na fonte, aumentando o potencial de fragmentação do bocal em instrumentos geralmente baseados em electrospray. Embora a fragmentação na fonte permita a análise da fragmentação, tecnicamente não é espectrometria de massa tandem, a menos que os íons metastáveis sejam analisados ou selecionados antes da auto-dissociação e um segundo estágio de análise seja realizado sobre os fragmentos resultantes. A fragmentação na fonte pode ser usada em vez da espectrometria de massa tandem através da utilização da tecnologia Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA), que gera fragmentação que combina diretamente com os dados da espectrometria de massa tandem. Os fragmentos observados pelo EISA têm maior intensidade de sinal do que os fragmentos tradicionais que sofrem perdas nas células de colisão dos espectrômetros de massa em tandem. O EISA permite a aquisição de dados de fragmentação em analisadores de massa MS1, tais como tempo de vôo e instrumentos quadripolares únicos. A fragmentação na fonte é frequentemente usada em adição à espectrometria de massa em tandem (com fragmentação pós-fonte) para permitir duas etapas de fragmentação em um pseudo experimento do tipo MS3.

Dissociação induzida por colisãoEditar

A fragmentação pós-fonte é a mais frequentemente usada em um experimento de espectrometria de massa em tandem. A energia também pode ser adicionada aos iões, que normalmente já estão excitados por vibração, através de colisões pós-fonte com átomos ou moléculas neutras, a absorção de radiação ou a transferência ou captura de um electrão por um ião com carga multiplicada. A dissociação induzida por colisão (CID), também chamada de dissociação ativada por colisão (CAD), envolve a colisão de um íon com um átomo neutro ou molécula na fase gasosa e a subseqüente dissociação do íon. Por exemplo, considere

AB + + M ⟶ A + B + + + M {\i}}}} {{{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}}

onde o íon AB+ colide com a espécie neutra M e depois se rompe. Os detalhes deste processo são descritos pela teoria da colisão. Devido a diferentes configurações instrumentais, dois tipos diferentes de CID são possíveis: (i) do tipo feixe (no qual os íons precursores são fragmentados em vôo) e (ii) do tipo armadilha de íons (no qual os íons precursores são primeiro presos, e depois fragmentados).

Um terceiro e mais recente tipo de fragmentação do CID é a dissociação de colisão de maior energia (HCD). O HCD é uma técnica CID específica para espectrômetros de massa orbitrap em que a fragmentação ocorre externa à armadilha de íons, ela acontece na célula do HCD (em alguns instrumentos chamados “ion routing multipole”). O HCD é uma fragmentação do tipo armadilha que demonstrou possuir características do tipo feixe. Existem bases de dados de espectrometria de massa tandem de alta resolução livremente disponíveis (por exemplo, METLIN com 850.000 padrões moleculares cada um com dados experimentais CID MS/MS), e são tipicamente utilizados para facilitar a identificação de pequenas moléculas.

Métodos de captura e transferência de electrõesEditar

A energia libertada quando um electrão é transferido para ou capturado por um ião com múltiplas cargas pode induzir fragmentação.

Separação de captura de electrõesEditar

Se um electrão é adicionado a um ião positivo com múltiplas cargas, a energia Coulomb é libertada. A adição de um electrão livre é chamada dissociação da captura de electrões (ECD), e é representada por

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragmentos ^{\\i1}->>>>504>504>504>504>504>504>504>504>504>505>505>505>505>505>505>505>505>505>505>506>506>506>506>506

para uma molécula M protonada multiplicada.

dissociação por transferência electrónicaEditar

Adicionar um electrão através de uma reacção iónica é chamada dissociação por transferência electrónica (ETD). Similar à dissociação por captura de elétrons, a ETD induz fragmentação de cátions (por exemplo, peptídeos ou proteínas) através da transferência de elétrons para eles. Ela foi inventada por Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka e Jarrod Marto na Universidade da Virgínia.

ETD não usa elétrons livres, mas emprega ânions radicais (por exemplo, antraceno ou azobenzeno) para este propósito:

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragmentos ao estilo do display ^{\i}+{\i}+{\i}{A^{\i}->}}esquerda ^{\i}{(n-1)+direita]^{*}+{\i}->fragmentos}}

onde A é o ânion.

ETD cliva-se aleatoriamente ao longo da espinha dorsal do péptido (iões c e z) enquanto as cadeias laterais e modificações como a fosforilação são deixadas intactas. A técnica só funciona bem para íons de estado de carga mais alto (z>2), porém em relação à dissociação induzida pela colisão (CID), a ETD é vantajosa para a fragmentação de peptídeos mais longos ou mesmo de proteínas inteiras. Isto torna a técnica importante para a proteômica de cima para baixo. Assim como o ECD, a ETD é eficaz para peptídeos com modificações como fosforilação.

Transferência de elétrons e dissociação de colisão de alta energia (EThcD) é uma combinação de ETD e HCD onde o precursor do peptídeo é inicialmente submetido a uma reação íon/íon com ânions fluoranteno em uma armadilha linear de íons, que gera c- e z-íons. Na segunda etapa, a fragmentação de íons HCD é aplicada a todos os íons derivados de ETD para gerar íons b- e y- antes da análise final no analisador de órbita. Este método emprega dupla fragmentação para gerar espectros de MS/MS ricos em dados para seqüenciamento de peptídeos e localização de PTM.

Dissociação negativa de transferência de elétronsEditar

Fragmentação também pode ocorrer com uma espécie desprotonada, na qual um elétron é transferido da espécie para um reagente catiônico em uma dissociação negativa de transferência de elétrons (NETD):

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragmentos ^{\an-}+{\an-{\an->}}{\an- esquerda^{\an-(n+1)-direita]^{*}+{\an-{\an->fragmentos}}}

Na sequência deste evento de transferência, o ânion deficiente em electrões sofre rearranjo interno e fragmentos. NETD é o análogo íon/íon da dissociação entre elétrons (EDD).

NETD é compatível com a fragmentação de peptídeo e proteínas ao longo da espinha dorsal na ligação Cα-C. Os fragmentos resultantes são geralmente um– e íons de produto tipo x.

Edit

Electron-detachment dissociation (EDD) é um método para fragmentação de espécies aniônicas na espectrometria de massa. Serve como um modo contador negativo para a dissociação da captura de elétrons. Os íons com carga negativa são ativados por irradiação com elétrons de energia cinética moderada. O resultado é a ejeção dos elétrons da molécula iônica pai, que causa a dissociação via recombinação.

Dissociação de carga-transferênciaEditar

Reação entre peptídeos com carga positiva e reagentes catiônicos, também conhecida como dissociação de transferência de carga (CTD), foi recentemente demonstrada como uma via alternativa de fragmentação de alta energia para os peptídeos em estado de baixa carga (1+ ou 2+). O mecanismo proposto de CTD usando cátions de hélio como reagente é:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragmentos ao estilo de um jogo…

Os relatórios iniciais são que o CTD causa a clivagem da ligação Cα-C dos peptídeos e fornece um… e iões de produto tipo x.

PhotodissociationEdit

A energia necessária para a dissociação pode ser adicionada por absorção de fótons, resultando em fotodissociação iônica e representada por

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{{AB+}+{\mathit {\nu }->{A}+B+}}}

>

where h ν {\an8014>>9136>

where h ν

representa o fóton absorvido pelo íon. Os lasers ultravioletas podem ser usados, mas podem levar a uma fragmentação excessiva de biomoléculas.

Dissociação multifotão infravermelhoEditar

Fótons infravermelhos irão aquecer os íons e causar a dissociação se um número suficiente deles for absorvido. Este processo é chamado de dissociação multifotônica infravermelha (IRMPD) e é freqüentemente realizado com um laser de dióxido de carbono e um espectrômetro de massa de retenção de íons, como um FTMS.

Desigualciação radiativa infravermelha de corpo negroEdit

A radiação de corpo negro pode ser usada para fotodissociação em uma técnica conhecida como dissociação radiativa infravermelha de corpo negro (BIRD). No método BIRD, toda a câmara de vácuo do espectrômetro de massa é aquecida para criar luz infravermelha. A BIRD utiliza esta radiação para excitar vibrações cada vez mais energéticas dos iões, até que uma ligação se rompa, criando fragmentos. Isto é semelhante à dissociação de multifótons infravermelhos que também usa luz infravermelha, mas de uma fonte diferente. A BIRD é mais frequentemente utilizada com a espectrometria de massa de ressonância de íons de transformada de Fourier.

Dissociação induzida pela superfícieEditar

Com a dissociação induzida pela superfície (SID), a fragmentação é o resultado da colisão de um íon com uma superfície sob alto vácuo. Hoje, o SID é usado para fragmentar uma ampla gama de íons. Anos atrás, só era comum usar o SID em espécies de menor massa, carregadas individualmente, porque os métodos de ionização e as tecnologias de análise de massa não eram suficientemente avançados para formar, transmitir ou caracterizar iões de alto m/z. Com o tempo, as superfícies mono camada auto-montadas (SAMs) compostas de CF3(CF2)10CH2CH2S sobre ouro têm sido as superfícies de colisão mais utilizadas para SID em um espectrômetro tandem. Os SAMs têm agido como os alvos de colisão mais desejáveis devido às suas massas eficazes caracteristicamente grandes para a colisão dos íons que chegam. Adicionalmente, estas superfícies são compostas por cadeias rígidas de fluorocarbono, que não amortecem significativamente a energia dos iões projécteis. As cadeias de fluorocarbono também são benéficas devido à sua capacidade de resistir à fácil transferência de elétrons da superfície do metal para os íons que chegam. A capacidade da SID de produzir subcomplexos que permanecem estáveis e fornecem informações valiosas sobre a conectividade é inigualável por qualquer outra técnica de dissociação. Como os complexos produzidos pela SID são estáveis e retêm a distribuição de carga no fragmento, isso produz um espectro único, que o complexo centra-se em torno de uma distribuição m/z mais estreita. Os produtos SID e a energia em que eles se formam são reflexo dos pontos fortes e da topologia do complexo. Os padrões únicos de dissociação ajudam a descobrir a estrutura quaternária do complexo. A distribuição simétrica da carga e a dependência da dissociação são exclusivas da SID e tornam os espectros produzidos distintos de qualquer outra técnica de dissociação.

A técnica SID é também aplicável à espectrometria de massa iônica-mobilidade (IM-MS). Três métodos diferentes para esta técnica incluem a análise da caracterização da topologia, da conectividade interunidades e do grau de desdobramento da estrutura proteica. A análise do desdobramento da estrutura proteica é a aplicação mais comumente utilizada da técnica SID. Para a espectrometria de massa de Ion-mobilidade (IM-MS), a SID é utilizada para a dissociação dos precursores ativados pela fonte de três tipos diferentes de complexos protéicos: proteína C reativa (CRP), transtiretina (TTR), e concanavalina A (Con A). Este método é utilizado para observar o grau de desdobramento de cada um destes complexos. Para esta observação, o SID mostrou as estruturas dos íons precursores que existem antes da colisão com a superfície. IM-MS utiliza o SID como uma medida direta da conformação para cada subunidade de proteínas.

Fourier-transform ion cyclotron ressonance (FTICR) são capazes de fornecer resolução ultra-alta e alta precisão de massa para instrumentos que fazem medições de massa. Estas características tornam os espectrômetros de massa FTICR uma ferramenta útil para uma grande variedade de aplicações, como vários experimentos de dissociação, como a dissociação induzida por colisão (CID, transferência de elétrons (ETD), e outros. Além disso, a dissociação induzida pela superfície tem sido implementada com este instrumento para o estudo da fragmentação de peptídeos fundamentais. Especificamente, o SID tem sido aplicado ao estudo da energética e da cinética da fragmentação em fase gasosa dentro de um instrumento de ICR. Esta abordagem tem sido utilizada para compreender a fragmentação em fase gasosa de peptídeos protonados, íons peptídeos de elétrons ímpares, complexos liga-péptido não covalentes e aglomerados metálicos ligados.