População estudantil
Esta investigação baseia-se nos coortes HAPIEE (Saúde, Álcool e Fatores Psicossociais na Europa Oriental) da Polônia, República Tcheca e Lituânia, e no seguimento de 8 anos da coorte alemã ESTHER (nome alemão: “Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung”) .
O estudo HAPIEE total é composto por coortes em quatro países. Como não foi possível exportar amostras de sangue da Rússia, apenas três coortes foram incluídas na análise atual. Os participantes do estudo foram recrutados em seis cidades checas (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec e Usti nad Labem) em 2002-2005 (n = 8.857), em Cracóvia, Polônia, em 2002-2005 (n = 10.728), e em Kaunas, Lituânia, em 2006-2008 (n = 7.161). Cada coorte é constituída por uma amostra aleatória de homens e mulheres, com idades entre 45-75 anos na linha de base, estratificados por sexo e grupos etários de 5 anos, seleccionados a partir de registos populacionais. A taxa de resposta global foi de 61%. Os dados foram coletados por questionário e um pequeno exame em uma clínica durante o qual foi colhida uma amostra de sangue venoso em jejum.
O estudo ESTHER é uma coorte baseada na população de 9.949 adultos, com idade entre 50-74 anos na linha de base, recrutados por seus médicos de clínica geral (GP) durante um check-up de saúde de rotina entre 2000 e 2002 no estado federal alemão de Saarland. A investigação actual baseia-se no seguimento de 8 anos, realizado entre Julho de 2008 e Dezembro de 2010, no qual os participantes do estudo tinham entre 56 e 85 anos de idade. Da linha de base ao acompanhamento de 8 anos, 499 indivíduos faleceram, 505 indivíduos não puderam mais participar devido à saúde precária, e 680 tinham diminuído ainda mais a participação. Dos restantes 8.265 participantes, 6.061 devolveram um questionário (taxa de resposta, 73,4%) e 4.637 doaram uma amostra de sangue no consultório do seu médico de família. Os GPs dos participantes do estudo também preencheram um questionário sobre o estado de saúde dos participantes do estudo (disponível para n = 5.997). Além disso, 3.124 participantes do estudo consentiram numa avaliação geriátrica adicional de 3 horas realizada por médicos do estudo nas casas dos participantes.
Variáveis nos estudos ESTHER e HAPIEE foram harmonizadas e os marcadores de stress oxidativo foram medidos no âmbito do Consórcio sobre Saúde e Envelhecimento: Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES; www.chancesfp7.eu), que foi descrito em outro lugar . Os estudos são conduzidos de acordo com a declaração de Helsinque e foi obtido o consentimento livre e esclarecido por escrito de todos os participantes do estudo.
Avaliação de vacinas
Nos estudos ESTHER e HAPIEE, os dados sociodemográficos, de estilo de vida e história de doenças foram avaliados por questionários auto-administrados. Altura e peso foram medidos e suplementados por informações auto-relatadas na ESTHER para os participantes do estudo que não consentiram com a visita domiciliar. Além das informações auto-relatadas, o histórico de doenças crônicas comuns foi validado no estudo ESTHER através da consulta aos registros médicos ou ao registro de câncer de Saarland. O comprometimento renal foi definido por uma taxa estimada de filtração glomerular <60 mL/min/1,73 m2, calculada com a equação de Colaboração da Epidemiologia da Doença Renal Crônica baseada em creatinina. Na coorte ESTHER, as concentrações séricas de creatinina foram avaliadas com um método cinético Jaffé em um Cobas 8000 C701 (analito: CREJ2 3000, Roche). O colesterol total e o colesterol lipoproteico de alta densidade (HDL) foram avaliados em amostras séricas por cromatografia enzimática (analitos: Chol2 2100, HDLC3 450, Roche) e a proteína C reativa (CRP) por imunoturbidimetria no Cobas 8000 C701 (analito: CRPL3 500, Roche). No HAPIEE, o colesterol total e HDL também foram avaliados com a mesma metodologia de ensaio e os analitos Roche, mas foram utilizados diferentes autoanalisadores (HAPIEE República Checa e Lituânia): Roche Cobas Mira; HAPIEE Polônia: Hitachi 917/Modular P). Além disso, em todos os coortes HAPIEE, creatinina sérica e PCR foram avaliados com a mesma metodologia de ensaio da ESTHER, mas com analitos de um fornecedor diferente (Beckman-Coulter) e em um autoanalisador diferente (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).
Apuração da mortalidade
Para essas análises, usamos o acompanhamento para mortalidade total por registros oficiais de mortalidade em todo o país (República Tcheca, Alemanha), local (Lituânia) ou regional (Polônia) até 31 de dezembro de 2010, na Polônia, 31 de dezembro de 2011, na República Tcheca e Lituânia, e até 31 de julho de 2014, na Alemanha. A mortalidade por causas específicas na Alemanha estava disponível apenas para mortes ocorridas até 2 de abril de 2013. Os registros estavam completos para todos os participantes que não se deslocaram para fora da região coberta do registro. A perda de acompanhamento devido à migração foi de 4% nos coortes HAPIEE (combinados) e de 2% no estudo ESTHER. Todas as mortes codificadas com os códigos CID-10 I00-I99 foram consideradas mortes cardiovasculares e mortes por câncer foram definidas pelos códigos CID-10 C00-C97.
Medição do marcador sérico de esforço oxidativo
Os ensaios usados para medir os níveis de d-ROMs (Diacron, Grosseto, Itália) e TTL (Relay Assay Diagnostics, Gaziantep, Turquia) foram adaptados a um autoanalisador (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Holanda) no Laboratório de Pesquisa em Proteção à Saúde (Bilthoven, Holanda), como descrito anteriormente . O ensaio d-ROMs mede a concentração de hidroperóxido em unidades de Carratelli (Carr U), nomeado em homenagem ao inventor do ensaio, Mauro Carratelli. Cada Carr U corresponde a 0,08 mg de peróxido de hidrogênio (H2O2)/100 mL na amostra . O ensaio TTL mede a concentração de grupos de tiol livre na amostra em μmol/L.
Medições foram realizadas em amostras de soro que foram armazenadas por aproximadamente 3-10 anos em freezers com -80 °C. d-ROMs e TTL têm uma boa estabilidade a longo prazo sob estas condições . No seguimento de 8 anos da ESTHER, as d-ROMs e TTL foram medidas em todos os participantes que doaram amostras de sangue no consultório do seu médico de família (n = 4.637). No entanto, as medições foram realizadas em dois momentos diferentes porque não havia financiamento disponível para medir todas as amostras no estudo piloto realizado em junho de 2012 . Para corrigir potenciais deslocamentos nos ensaios, 80 amostras do ponto temporal 1 (Junho de 2012) foram novamente medidas no ponto temporal 2 (Setembro de 2014) e foram obtidas equações de regressão linear que foram utilizadas para padronizar os resultados do ponto temporal 2 para os níveis do ponto temporal 1, quando as medições nos coortes HAPIEE também se realizaram (ao longo do ano de 2012). A concordância das medidas d-ROMs foi alta (coeficiente de correlação de Spearman r = 0,92 e diferença de médias = 15 Carr U) e, portanto, nenhuma correção foi aplicada. Para TTL, uma mudança óbvia nos resultados do ensaio (r = 0,88 e diferença de médias = 81 μmol/L) foi corrigida pela aplicação da seguinte equação a todas as medições do ponto temporal 2: TTLtime-point2 = 0,746 × TTLtime-point1. Além disso, excluímos 610 medidas em amostras de sangue que não preenchiam critérios rigorosos de qualidade hemolítica, ictérica e lipêmica no estudo ESTHER, deixando 4.027 para análise no presente estudo. Nos coortes HAPIEE, o número de amostras que não preencheram esses critérios de qualidade foi insignificante.
Amostra de estudo analítico
Por causa do financiamento limitado, os níveis de d-ROMs e TTL não foram medidos em todos os participantes dos coortes HAPIEE; em vez disso, foi adotado um desenho de controle de caso compatível (arquivo adicional 1: Figura S1). Os casos foram definidos como todos os sujeitos que morreram durante o acompanhamento (n = 1.433) ou que sofreram infarto do miocárdio não fatal (IM) ou acidente vascular cerebral (n = 658). Os controles (n = 4.396) foram ajustados para os casos por sexo e grupos de 5 anos de idade. Para corrigir a superamostragem para IM e AVC nesta análise de mortalidade, os sujeitos com IM não fatal ou AVC não fatal durante o acompanhamento foram excluídos dos casos em uma primeira etapa. A fim de adicionar uma amostra representativa de indivíduos com acidente vascular encefálico não fatal ou eventos de AVC aos controles, em uma segunda etapa, foi calculada a proporção observada de eventos não fatais de acidente vascular encefálico ou eventos de AVC em cada estrato específico de idade e sexo no total da coorte. Em uma terceira etapa, essas proporções foram multiplicadas pelos tamanhos das amostras em cada estrato dos controles com marcadores de estresse oxidativo medidos. Em uma quarta etapa, os números resultantes foram selecionados aleatoriamente em cada estrato do grupo de indivíduos com IM ou AVC incidente não fatal e adicionados aos controles, resultando em um pool de 4.552 controles elegíveis para os 1.433 óbitos. Na etapa final, o pool de controles elegíveis foi usado para combinar individualmente exatamente dois controles para cada morte por coorte, sexo e idade (±5 anos).
Análises estatísticas
Diferenças nas características basais entre casos (morte durante o acompanhamento) e controles foram avaliadas com o teste χ2 para variáveis categóricas e o teste Wilcoxon rank-sum para variáveis contínuas. Associações transversais de fatores de risco estabelecidos para mortalidade com altos níveis de estresse oxidativo foram avaliadas com modelos de regressão logística compreendendo todas as características da linha de base modeladas como variáveis categóricas (Tabela 1). A variável dependente “estresse oxidativo elevado” foi definida por duas definições diferentes com base nos níveis d-ROMs ou TTL. Para d-ROMs, de acordo com as instruções do fabricante, foi empregado um corte clínico de >400 Carr U, que classificou 23% da coorte ESTHER e 30% dos controles elegíveis da coorte HAPIEE na categoria de “alta” tensão oxidativa. Para TTL, não há cortes clínicos disponíveis e, como o ensaio ainda não está padronizado, a população significa que variou fortemente entre as coortes. Portanto, para fazer corresponder a proporção de indivíduos com alto estresse oxidativo obtido pela definição baseada nos níveis d-ROMs, foi utilizado o quartil de TTL específico da coorte inferior (25%) para classificar os sujeitos a uma categoria de alto estresse oxidativo baseado na TTL. As análises transversais foram realizadas em todos os sujeitos e separadamente para mulheres e homens.
Para análises longitudinais, A regressão de risco proporcional Cox (ESTHER cohort) e a regressão logística condicional (HAPIEE matched case-control study) foram utilizadas para estimar os índices de risco e odds ratios, respectivamente, para um aumento nos níveis de d-ROMs e uma diminuição na TTL por um desvio padrão específico da coorte (SD). Além disso, os níveis de d-ROMs também foram modelados como uma variável categórica, com cortes clínicos recomendados pelo fabricante para moderados (341-400 Carr U), altos (401-500 Carr U) e muito altos de estresse oxidativo (>500 Carr U) com referência a indivíduos com estresse oxidativo não aumentado ou baixo (≤340 Carr U). Quando o risco absoluto é baixo, a regressão logística e Cox geralmente produzem resultados semelhantes e a razão de probabilidade pode ser considerada como uma aproximação da razão de risco mais precisa. Usamos o termo risco relativo (RR) para ambas as estimativas de efeito. Na análise de sensibilidade, as análises sobre mortalidade por causas específicas na coorte ESTHER foram realizadas considerando o risco de morte concorrente devido a outras causas, ajustando um modelo de regressão proporcional de risco de subdistribuição com pesos para sujeitos que passaram pelo evento de risco concorrente de acordo com uma extensão do método Fine and Gray . Entretanto, os resultados foram quase idênticos à regressão de risco proporcional de Cox tradicional e, portanto, apenas os últimos resultados são mostrados neste manuscrito.
Análises foram conduzidas separadamente para cada coorte e agrupadas por meta-análise com ponderação de Mantel-Haenszel e efeitos aleatórios, levando em consideração o tamanho da amostra das coortes e a possibilidade de heterogeneidade estatística entre os estudos. Este último foi examinado com o teste Q de Cochrane e a estatística I2.
Foram analisados os seguintes resultados: mortalidade por todas as causas, DCV, câncer e não DCV, causas não carcinogênicas. Para cada resultado, foram desenvolvidos quatro modelos estatísticos, com uma crescente inclusão de fatores de risco de mortalidade estabelecidos nos modelos. Os níveis de d-ROMs e TTL foram sempre incluídos no mesmo modelo porque sua correlação foi baixa (r <0,08 em cada coorte). No modelo 1, o ajuste foi feito para idade e sexo na coorte ESTHER, enquanto que isto não foi necessário para as coortes HAPIEE porque os casos foram ajustados individualmente para dois controles por idade e sexo e analisados em análise estratificada na qual os estratos consistem na coleta de conjuntos ajustados. O modelo 2 foi ajustado adicionalmente para educação, índice de massa corporal (IMC), tabagismo, consumo de álcool e atividade física. O modelo 3 também incluiu doenças que poderiam potencialmente mediar a associação do estresse oxidativo com a mortalidade (ou seja, dislipidemia (avaliada pelo colesterol total e HDL), comprometimento renal, histórico de diabetes, hipertensão arterial, IM, acidente vascular cerebral e câncer). Finalmente, o modelo 4 foi ajustado adicionalmente para os níveis de PCR, que foram fortemente correlacionados com os níveis de d-ROMs (r = 0,34-0,41 nas coortes) e, menos fortemente, com TTL (r = 0,11-0,17 nas coortes). A idade foi modelada como uma variável contínua e todas as outras variáveis foram modeladas como variáveis categóricas (as categorias são mostradas na Tabela 1). Testamos as interações entre d-ROMs/TTTL com covariantes adicionando termos de interação apropriados ao modelo 2,
Subgrupos a serem analisados foram escolhidos a priori com o objetivo de estratificar para os mais importantes determinantes potenciais de altos níveis de estresse oxidativo: coorte/país, idade, sexo, história de IM ou câncer e estado inflamatório. Devido às limitações de tamanho da amostra, as análises estratificadas foram restritas à mortalidade de todas as causas, à DCV e ao câncer. Para abordar a possibilidade de viés de causa inversa, foram realizadas análises separadamente para eventos que ocorreram nos anos 1-2, anos 3-4 e anos 5-6 de acompanhamento. Devido às limitações do tamanho da amostra, esta análise estratificada só pôde ser realizada para mortalidade por todas as causas. Para evitar instabilidade do modelo, um resultado de análise de subgrupo específico da coorte só foi considerado para meta-análise quando pelo menos 25 eventos ocorreram no subgrupo.
Atribuição múltipla foi empregada para imputar o número de valores covariáveis basais ausentes mostrados no arquivo adicional 1: Tabela S1. A proporção de valores ausentes foi inferior a 5% para todas as variáveis, com exceção do consumo de álcool e da atividade física, que teve até 22% dos valores ausentes. Tanto quanto sabemos, os dados estavam faltando ao acaso, o que é a suposição da imputação múltipla. Separadamente por coorte, status do caso e sexo, 20 conjuntos de dados completos foram imputados com o procedimento SAS 9.3 “PROC MI”, usando o método de cadeia de Markov Monte Carlo. Variáveis do modelo “completo” foram utilizadas para o modelo de imputação. Todas as análises multivariáveis foram realizadas nos 20 conjuntos de dados imputados e os resultados dos conjuntos de dados individuais foram combinados pelo procedimento SAS 9.3 “PROC MIANALYZE”.
As meta-análises foram realizadas com o software estatístico Comprehensive Meta-Analysis 2.0 (Biostat, Englewood, NJ, EUA). Todas as outras análises foram conduzidas com SAS, versão 9.2 (Cary, Carolina do Norte, EUA). Todos os testes estatísticos foram em duas faces, usando um nível alfa de 0.05.