Frontiers in Neurology

Introduction

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada principalmente por uma síndrome motora com expressão variável de disfunção do neurônio motor inferior (LMN) e superior (UMN). Os critérios do El Escorial (1) requerem o envolvimento de UMN e LMN em uma ou mais regiões do corpo para se fazer o diagnóstico da ELA definitiva. Os sinais UMN podem ser espasticidade, reflexo tendinoso aumentado ou preservado e resposta plantar extensora. Os movimentos espelhados (MMs) têm sido repetidamente relatados na ELA (2-4), mas ainda não fazem parte dos critérios diagnósticos. Os MMs são movimentos involuntários contralaterais a um movimento de dedos pretendido. Os MMs podem ser vistos em crianças normais até aos 10 anos de idade, mas a sua prevalência e intensidade diminui após esta idade (5-7) muito provavelmente reflectindo a maturação do corpo caloso (8). A persistência ou manifestação nova de MMs em adultos pode surgir a partir de uma variedade de etiologias. MMs congênitas persistentes têm sido descritas em diferentes condições, desde a ausência de outras anormalidades neurológicas até hemiparesia congênita grave na paralisia cerebral (9). MMs também têm sido relatados em uma variedade de outras condições adquiridas, como doença de Parkinson (DP) (10, 11) ou acidente vascular cerebral (12, 13). Duas hipóteses principais para o desenvolvimento de MMs foram discutidas: desenvolvimento anormal do sistema motor primário, envolvendo o trato corticospinal ipsilateral, e ausência de mecanismos inibidores do córtex motor contralateral, principalmente através do corpus calosum (9, 14). A base fisiopatológica dos MMs em todas essas condições clínicas adquiridas é considerada como sendo o resultado de uma alteração predominante das vias de projeção do calosso. Entretanto, um mau funcionamento cortical ou piramidal adicional ou pré-existente parece ser necessário para o desenvolvimento de MMs (2). Além disso, foi constatado que os MMs estão associados à inibição transcallosal reduzida (TI), medida pela estimulação magnética transcraniana (TMS) na ALS, PD e AVC (3, 4, 15-17). Independentemente do mecanismo fisiopatológico exato dos MMs, o aspecto clínico mais importante é que eles estão refletindo o envolvimento do SNC pela condição patológica subjacente. Técnicas de RM de difusão, tais como difusão tensorial (DTI) foram estabelecidas para estudar a integridade dos traços neuronais in vivo no cérebro humano. Estudos com DTI encontraram alterações na integridade do trato das fibras em doenças neurodegenerativas como Alzheimer e ALS (18-21), incluindo envolvimento de calosal (22-24). Um estudo observacional encontrou uma redução consistente na anisotropia fracionária no corpo caloso dos pacientes com ELA, estendendo-se rostralmente e bilateralmente para a região dos corticais motores primários (23). Um estudo mais recente utilizando DTI e TMS para caracterização da neurodegeneração na ELA e concluiu um papel complementar como biomarcadores diagnósticos da disfunção UMN (25). Ellis e colegas encontraram um aumento significativo na difusividade média e redução da anisotropia fracionária ao longo do trato corticospinal em pacientes com ALS com correlação com a gravidade da doença e envolvimento UMN (26). Nenhum destes estudos focou MMs ou conectividade funcional na ALS.

Por isso, estudamos associações de medidas funcionais de TMS com marcadores de difusão de integridade estrutural do corpo caloso e trato cefalorraquidiano em uma amostra prospectiva de pacientes com ALS exibindo MMs para elucidar os conceitos fisiopatológicos de MMs na ALS. Hipotecamos que pacientes com ELA com MMs mostrariam integridade funcional prejudicada do corpo caloso, associada ao declínio dos marcadores de integridade estrutural. Tais achados suportariam o papel da disfunção calosa e do comprometimento estrutural das MMs na ELA.

Patientes e Métodos

Subjetos

Ninze pacientes com ELA e 20 sujeitos saudáveis de controle foram submetidos à avaliação clínica, e exames de RM, incluindo DTI. A data demográfica detalhada e a característica clínica de toda a coorte do estudo são mostradas na Tabela 1. Todos os sujeitos foram destros conforme avaliados pelo inventário de Edimburgo (27). No momento do exame, 4 pacientes apresentaram ELA definitiva, 8 ELA provável e 4 ELA possível de acordo com os critérios revisados do El Escorial (1). Três pacientes apresentaram variante do neurônio motor inferior. A duração média da doença foi de 34,8 ± 34,8 meses. A avaliação clínica consistiu no exame neurológico com especial respeito à mão; os MMs foram avaliados por batimento sequencial de uma mão sem controle óptico e observação dos MMs de acordo com o procedimento de Woods e Teuber (28), e a avaliação da escala de classificação funcional da ALS revisada (-R) (29). Além disso, para abordar o envolvimento do neurônio motor superior (UMN) foi calculada uma “carga” UMN (UMNB) totalizando o número de sinais UMN patológicos no exame (pontuação máxima 16) (30). Para o rastreio cognitivo utilizámos a “avaliação cognitiva de Montreal” (MOCA) (31). O escore MOCA variou entre 18 e 29 com média de 24,5 ± 4 para os pacientes com ELA, e entre 27 e 29 com média de 27,6 ± 0,7 para os controles (P = 0,006). Os controles não apresentaram queixas cognitivas e pontuaram dentro de 1,5 desvios padrão da idade MOCA e do valor da norma ajustada para educação.

Patientes e indivíduos controle só foram incluídos no estudo se o consentimento por escrito tiver sido dado. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Rostock (A-2011-0026, A 2012-0083).

>

Estimulação Magnética Transcraniana

Realizamos TMS em todos os pacientes e em 10 dos 20 controles saudáveis. O tempo de condução motora central (CMCT), as amplitudes dos potenciais evocados motores (MEP) e o período de silêncio contralateral (cSP) foram determinados em todos os pacientes com ALS e sujeitos de controle. Os MEP foram registrados do primeiro músculo interósseo dorsal (IED) e do músculo tibial anterior (TA) usando uma bobina circular padrão (diâmetro externo de 9 cm) conectada a um estimulador Magstim 200 (Magstim Co., Whitland, Dyfeld, UK). Para a aquisição de dados foi utilizado um sistema MEP comercialmente disponível (Brain Quick System Plus, Inomed, Erlangen, Alemanha). A investigação do período de silêncio ipsilateral (iSP) foi realizada com uma bobina focal (diâmetro do laço externo 7 cm). A bobina foi orientada para induzir um fluxo de corrente direcionada para posterior-anterior na área da mão do córtex motor; o ponto de excitabilidade ótima (POE) do músculo IED foi determinado sobre o córtex motor contralateral; o TMS foi aplicado no POE com 1,5 vezes o limiar motor de repouso (RMT) enquanto os sujeitos realizaram uma ativação tônica máxima do músculo IED ipsilateral e enquanto mantiveram o músculo IED contralateral relaxado como publicado em detalhes anteriormente (3). Para a determinação da latência e duração do iSP, foram utilizados 10 ensaios para cada hemisfério. Após a retificação off-line e o cálculo da média dos sinais EMG, os parâmetros iSP foram analisados.

Aquisição por RM

Aquisições por RM do cérebro foram conduzidas usando um scanner de RM 3-Tesla com uma bobina de cabeça em fase de 32 canais e capacidade de imagens paralelas (Magnetom Verio, Siemens, Erlangen, Alemanha, software syngo MR B17). Os sujeitos foram escaneados em uma única sessão sem alterar sua posição no scanner. Foram utilizadas as seguintes sequências: Adquirimos uma magnetização sagital de alta resoluçãoT1 preparada com eco de gradiente de aquisição rápida (MP-RAGE) sequência 3D, tamanho de matriz de 256 × 256 × 192, tamanho de voxel isométrico 1,0 mm3), TE/TI/TR de 4,82 ms/1.100 ms/2.500 ms, ângulo de viragem 7°. Para identificar lesões de matéria branca foi realizada uma sequência bidimensional ponderada em T2 (FLAIR de recuperação da inversão da atenuação do fluido, tamanho da matriz de 384 × 187, 24 fatias com espessura de corte de 5,0 mm, TE/TI/TR de 94 ms/2.500 ms/9.000 ms, ângulo de viragem de 150°). A imagem ponderada por difusão foi realizada com uma sequência de eco-imagem plana (TE/TR de 81 ms/12.700 ms). Os gradientes de difusão foram aplicados em 30 direções espaciais diferentes. Os valores de b foram 0 e 1.000 s/mm2. As imagens tinham um tamanho de matriz de 128 × 128 mm, espessura de corte de 2 mm, o tamanho de voxel resultante foi 2,0 × 2,0 × 2,0 mm2,

MRI Data Processing

DTI data were pre-processed using the DTI tool box of the FSL software (http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/, FMRIB, Oxford, UK, Version 4.1) (32). Aplicamos primeiramente correções para correntes de Foucault e movimento da cabeça. O crânio foi removido usando a Ferramenta de Extração Cerebral para diferenciação de tecido cerebral e tecido não cerebral usando uma máscara binária (limiar 0,15-0,3) e os tensores de difusão foram ajustados aos dados com ajuste DTI (FMRIB Image Analysis Group, Oxford, UK). Foram criados mapas de anisotropia fracionada (FA) e difusividade média (MD), assim como mapas de difusividade axial (AD) e difusividade radial (RD).

TBSS análise (estatística espacial baseada em trato) foram realizados usando o software FMRIB (versão 4.1 www.fmrib.ox.ac.uk/fsl) (33). O TBSS permite a reorientação espacial dos mapas de FA para um espaço padrão sem efeitos sistemáticos de transformação espacial na direcionalidade do trato de fibra e sem a necessidade de selecionar um núcleo de suavização espacial que possa impactar nos efeitos desejados (22). O processamento de mapas de difusividade consistiu nos seguintes passos: Os mapas FA foram transformados em espaço MNI (Montreal Neurologic Institute). Os mapas de FA normalizados de todos os sujeitos foram calculados e esqueletizados com um limiar normalizado de 0,2. Com base no estudo específico com os esqueletos de matéria foi criado um esqueleto individual para cada sujeito.

Para análise específica das mudanças na difusividade dos trajetos de fibras individuais, realizamos uma análise de região de interesse (ROI). A seleção de ROIs da JHU foi feita conforme descrito anteriormente (34). Com base no atlas de matéria branca JHU (35) definimos sete regiões: corpus callosum com sub-regiões genuínas, truncus e splenium, trato corticospinal e crostas posteriores da cápsula interna em ambos os lados. O processamento de dados foi feito pelo software Matlab 2013a (MathWorks Inc., MA, Natrick, EUA) (Figura 1).

Para análise da correlação entre os valores de TMS e as medidas de DTI, realizamos uma análise da região de interesse (ROI) usando MarsBaR (36) para extrair valores médios do corpus callosum e trato corticospinal esquerdo e direito, respectivamente.

Análise estatística

Análise estatística foi realizada para os escores clínicos, medidas de TMS e dados de ROI no SPSS (versão IBM SPSS statistics 20). Para toda a análise cerebral foi utilizada a caixa de ferramentas “Randomize” em TBSS no FMRIB (versão 4.1 www.fmrib.ox.ac.uk/fsl). Todos os escores clínicos e parâmetros TMS mostraram uma distribuição normal, que foi testada pelo uso do teste Kolmogorov Smirnov (P > 0.1). As diferenças nos parâmetros TMS foram comparadas entre os grupos usando o teste t de Student. Os resultados das medidas da PSI foram dicotomizados em patologia vs. não patológica, e analisados pelo teste Chi2.

Para análise do ROI, comparações grupais de FA de pacientes e controles foram realizadas de acordo com os achados da PSI patológica e da PSI não patológica em uma análise de variância univariada e subseqüentes testes post-hoc. Além disso, foram calculadas as correlações entre os achados da PSI e os parâmetros da ALSFRS e da FA de todos os ROI investigados. Para a análise de correlação utilizou-se a correlação Spearman-Rank e a significância foi definida em P < 0,05.Para a análise cerebral total, investigaram-se as diferenças de grupo na anisotropia fracionária e difusividade média utilizando o modelo linear geral em base voxel. Foram realizadas análises cerebrais integrais para todos os parâmetros de difusão. Os mapas FA, MD, RD e AD foram comparados por análise de variância univariada (fator: grupo, covariada: ALSFRS-R e UMNB). Para evitar superestimação da significância, foi aplicado um teste de comparações múltiplas (método do erro familiar) e a significância foi definida em P < 0,05.

Resultados

Resultados da TMS

A investigação da TMS em pacientes com ALS revelou uma latência média de iSP de 41,3 ± 5,4 ms/40,9 ± 5,7 ms (direita/esquerda), que foi maior que a dos controles saudáveis 39,0 ± 4,6/37,7 ± 6,3 (direita/esquerda) (p = 0,006/0,012). Não foram encontradas diferenças para a duração da PSI entre os pacientes com ELA e os indivíduos controles. Doze pacientes com ALS (63,2%), mas nenhum dos controles mostrou perda de iSP. cSP foi numericamente menor nos pacientes com ALS do que nos controles sem atingir significância. Os pacientes com ELA tiveram uma RMT média significativamente menor em comparação aos controles (os resultados da TMS são mostrados em detalhes na Tabela 2 e Figura 2).

Diferenças de grupo na Anisotropia Fracionária e Difusividade Média

No que diz respeito às análises das ROIs pré-especificadas, os valores da FA do TCA foram significativamente menores nos pacientes com ELA em comparação com os controles. Os valores de FA dos diferentes ROIs do corpus callosum (genu, splenium e corpo) não diferiram entre os dois grupos (Tabela 3). Os valores de AD e RD apresentaram achados semelhantes. A análise do cérebro inteiro não mostrou diferenças na FA, MD, RD e DA entre pacientes com SLA e controles com nível de significância corrigido de FWE.

Correlação do Parâmetro Clínico, Parâmetros TMS e Medidas DTI

Nós encontramos correlações negativas significativas dos valores de FA do CST com valores de RMT em ambos os lados em pacientes com ALS, mas não em controles (Tabela 4). Não houve correlação significativa entre os valores de FA e os parâmetros iSP (Tabela 4). Em contraste, houve correlação significativa dos escores ALS-FRS-R com os valores de FA da TCA em ambos os lados (r CST-direita, ALS-FRS-R = 0,58, p = 0,009 e r CST-esquerda, LS-FRS-R = 0,05, p = 0,02), mas não com os valores de FA do corpo caloso.

Discussão

Disfunção dos neurónios motores inferior e superior é uma marca clínica da ELA. Além do envolvimento de áreas motoras primárias, uma disfunção calosa precoce também tem sido sugerida na ELA (37). As MMs podem ser um sinal clínico de vias transcalosas disfuncionais e podem ser observadas em ~30% dos pacientes com ELA. Outras evidências para a interpretação de MMs como marcadores de disfunção calosa vêm de uma série de estudos de TMS mostrando disfunção calosa como indicada pela inibição transcalosal prejudicada (2-4, 15) em conjunto com a presença de MMs na ALS e outras condições como a doença de Parkinson (16). Além disso, vários estudos DTI têm mostrado mudanças microestruturais não só no trato piramidal, mas também no corpo caloso na ELA (22, 23, 38). O envolvimento caloso tem demonstrado ser uma característica relativamente consistente da ELA, mesmo sem envolvimento clínico UMN, e pode refletir a propagação interhemisférica da patologia e uma conectividade motora estrutural comprometida (23, 24).

No estudo atual, esperávamos uma correlação significativa das medidas do DTI e dos achados do TMS refletindo a inibição transcalosal em pacientes com ELA com MMs. Consistente com nossa expectativa, encontramos uma inibição transcallosal prejudicada em até 68% dos casos, o que está de acordo com dados previamente publicados por coortes independentes (3, 4). Em contraste, entretanto, pacientes com ELA com MMs na amostra atual não demonstraram envolvimento microestrutural do corpo caloso, o que está em contraste com alguns (22, 34), mas não com todos os estudos anteriores (39). Uma interpretação da falta de alterações do corpus calosum em nosso estudo pode ser que nossos pacientes exibiram um distúrbio funcional anterior potencialmente anterior aos achados microestruturais nas vias transcalares. Assim, os dois estudos anteriores que encontraram alterações na difusão calosa do corpus (23, 41) incluíram casos funcionalmente mais avançados (escore ALSFRS-R médio 33,1 e 36,5, respectivamente, em comparação com 38,5 no estudo atual). Um estudo recente demonstrou aumento do AD no corpus callosum e redução do FA no CST direito na ALS sem considerar os MMs (25). O estudo de Geraldo et al. não teve foco nas alterações eletrofisiológicas nas vias de projeção transcallosal, mas a excitabilidade cortical e as propriedades de condução de CST foram testadas pela investigação do limiar motor de repouso (RMT) como medida da excitabilidade cortical e do tempo de condução do motor central (CMCT). Tendo em mente que Geraldo e seus colegas de trabalho usaram um pequeno músculo da mão diferente como músculo alvo (abdutor digiti minimi vs. primeiro músculo interósseo dorsal em nosso estudo) o RMT foi ligeiramente menor em nosso estudo refletindo uma maior excitabilidade cortical em nossa coorte exibindo MMs. As medidas de CMCT exibiram valores comparáveis ao nosso estudo. Estendendo esses achados anteriores a pacientes com MMs na ALS, pudemos replicar a redução da FA associada às alterações da TMS na ALS, sem efeitos no corpus calosum. Outra explicação para a falta de significância dos achados de DTI no corpus calosum da nossa amostra pode ser a relativa grande heterogeneidade dos pacientes, o que representa uma limitação do nosso estudo. Outra limitação é o baixo número de pacientes. Uma razão importante para esta circunstância pode ser a relativa raridade dos MMs, que pode ser observada em apenas cerca de 30% dos pacientes com ALS. Devido a limitações no recurso de pessoal disponível, o período do estudo não pôde ser estendido.

Em conclusão, este é o primeiro estudo que investiga uma coorte de pacientes com ELA que estavam todos exibindo MMs. O presente estudo reproduz e estende os achados anteriores sobre a redução da integridade do trato fibroso em pacientes com ELA com MMs, mas não mostrou mudanças microestruturais acompanhando movimentos espelhados e inibição transcallosal perturbada. A afeição do trato piramidal parece ser uma importante pré-condição para o desenvolvimento de MMs. Este estudo acrescenta mais evidências para o entendimento da conectividade prejudicada em pacientes com ELA. Portanto, são necessários mais estudos em coortes maiores e mais homogêneas.

Data Availability Statement

Deidentified participant data will be shared, as well as the study protocol and statistical analyses, upon reasonable request.

Ethics Statement

Os estudos envolvendo participantes humanos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Rostock (A-2011-0026, A267 2012-0083). Os pacientes/participantes deram seu consentimento por escrito para participar deste estudo.

Contribuições dos autores

MW: concepção, desenho, redação do manuscrito, aquisição de dados e aprovação final do manuscrito. NW, AG e EK: aquisição de dados, revisão do manuscrito e aprovação final do manuscrito. ST: concepção, desenho, análise e interpretação dos dados, redação do manuscrito, revisão do manuscrito e aprovação final do manuscrito.

Conflito de Interesses

ST realizou os trabalhos listados abaixo (todos na Alemanha): MSD Sharp & Dohme GmbH, Lindenplatz 1, 85540 Haar

11.09.2018- Círculo de qualidade para médicos em Kühlungsborn, Fale: “Demência e Diabetes – relatório atual”

14.11.2018-MSD Experimentforum: NAB Alzheimer em Munique, participante como consultor

13.08.2019-Evento “Diabetes e Demência” em Rostock, Palestra: “Demência e Diabetes – relatório atual” ROCHE Pharma AG, Emil-Barell-Str. 1, 79639 Grenzach-Wyhlen

12.09.2019–3. National Advisory-Board em Frankfurt am Main, participação como consultor

27.09.2019-ROCHE Symposium at the DGN Congress in Stuttgart, Talk: “Amyloid as target for diagnosis and treatment in Alzheimer’s disease”

Os demais autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.