Heterogeneidade Clínica e Genética da Síndrome de Microdeleção 15q13.3

Abstract

A microdeleção 15q13.3 é um CNV recorrente, presumivelmente mediado por NAHR entre duplicações segmentares no cromossomo 15. A deleção e duplicação 15q13.3 estão associadas a uma ampla gama de manifestações clínicas, tais como déficits intelectuais, convulsões, autismo, linguagem e atraso no desenvolvimento, deficiências neuropsiquiátricas e problemas comportamentais que ilustram penetração e expressividade incompletas. Este estudo compreende uma avaliação de 106 pacientes sintomáticos portadores da deleção heterozigótica, bem como de 21 pacientes portadores da duplicação, que foram descritos em estudos anteriores. A análise mostra uma heterogeneidade considerável para a manifestação de diferentes sintomas-chave e ocorrência familiar. Além disso, 8 novos pacientes são introduzidos. Convoluções nas conexões familiares dão novos insights sobre a complexidade da manifestação sintomática. Em estudos anteriores, foram expressas diferentes opiniões sobre a natureza e a localização precisa dos pontos de quebra de deleção. Aqui, mostramos que não CHRNA7 e CHRFAM7A, mas sim FAM7A ou GOLGA8, servem como regiões de ponto de ruptura em relação aos nossos pacientes. A deleção é descrita como heterogênea em tamanho. Entretanto, assumimos que não apenas os diferentes pontos de quebra, mas também a imprecisão da análise aCGH no cromossomo 15 devido às duplicações segmentares são responsáveis pela variabilidade no tamanho.

© 2016 S. Karger AG, Basiléia

A síndrome de microdeleção 15q13.3 (OMIM 612002), que foi primeiramente descrita por Sharp et al. , é um VCN recorrente, presumivelmente mediado por NAHR entre duplicações segmentares (BP3-BP5, BP4-BP5) no cromossomo 15. A deleção e duplicação 15q13.3 estão associadas a uma ampla gama de distúrbios neurodevelopmentais, tais como déficits intelectuais, convulsões, autismo, linguagem e atraso no desenvolvimento, deficiências neuropsiquiátricas e problemas comportamentais mostrando penetração incompleta e expressividade variável. A deleção típica de 1,6-Mb abriga 7 genes: ARHGAP11B, MTMR10, MTMR 15, TRPM1, KLF13, OTUD7A, e CHRNA7. Os códigos CHRNA7 para o receptor neuronal alfa-7 nicotínico de acetilcolina e, portanto, é considerado o principal gene candidato responsável pelas características clínicas expressas.

Neste estudo, descrevemos 6 pacientes até o momento inéditos portadores da típica microdeleção 15q13,3 entre a BP4 e a BP5, incluindo uma família com 4 membros afetados que são descritos mais adiante. Além disso, 1 paciente com duplicação de 15q13,3 e 1 paciente portador de deleção de 3,4-Mb entre a BP3 e a BP5 são descritos.

Além disso, a fim de explicar a variedade de manifestações clínicas e a gravidade dos sintomas, revisamos os dados de 106 pacientes sintomáticos com heterozigotos 15q13.3 deleções e 21 pacientes com duplicações que foram relatadas.

Em estudos recentes, surgiram diferentes opiniões sobre a natureza e a localização precisa dos pontos de quebra de deleção. Nós investigamos a localização dos pontos de quebra usando FISH, a fim de confirmar até que ponto essas opções se provam verdadeiras para nossos pacientes.

Métodos

Exploração de DNA e Array CGH

Leucócitos de sangue periférico foram usados como fonte de DNA. A análise de Array-CGH foi realizada usando um slide Sure Print 4x180K (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, EUA). O DNA do paciente foi rotulado com Cy3, DNA de referência com Cy5. A hibridação foi realizada usando DNA Cot-1 (1,0 µg/ml). As amostras de ADN testadas foram hibridizadas com ADN de referência (Agilent) compatível com o género. As etapas de purificação, hibridação e lavagem foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Foram utilizados o Sure Scan microarray Scanner G2600D (Agilent), o software de extracção de características (Agilent) e o Agilent Cytogenomics Software Edition 2.0.6.0.

FISH and Breakpoint Analysis

Slides com metáfase de linfócitos periféricos cultivados tinham sido armazenados a -70°C. Antes da hibridação, as lâminas foram processadas em uma série alcoólica (70, 80 e 100%), seguida pelo tratamento com pepsina (15 min, 37°C). BACs marcados com fluorescência (Illumina®, BlueFish) foram usados como sondas FISH. As etapas de preparação, hibridação e lavagem das sondas foram realizadas de acordo com as instruções do Illumina.

Sondas BAC utilizadas foram RP11-11H9, 22.067.176-22.300.706, chr.15q11.2; RP11-40J8, 30.546.758-30.724.265, chr.15q13.2; RP11-348B17, 31.281.641-31.502.115, chr.15q.13.3; RP11-265I17, 32.293.149-32.457.541, chr.15q13.3; RP11-280K19, 32.654.212-32.821.799, chr.15q13.3, e RP11-232J12, 53.792.861-53.948.902, chr.15q21,3 (ver fig. 1, hg19).

Resultados

Avaliação clínica

Os pacientes foram inicialmente observados por ocasião do exame neuropediátrico devido a déficits intelectuais e/ou atraso no desenvolvimento. A Tabela 1 resume os achados citogenéticos e clínicos.

Descrição dos pacientes

Patiente 1 (III/1)

A menina de 13 anos de idade apresentou distúrbio de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH), déficits intelectuais, atraso no desenvolvimento, infecções respiratórias recorrentes e escoliose. Seu peso e circunferência da cabeça (OFC) variam em torno do percentil 10 (P), respectivamente P90. Ela frequenta uma escola especial. Sua mãe (II/2, na fig. 2) também freqüentou uma escola de educação especial e a completou com sucesso. Ambos os pais não estiveram disponíveis para mais investigações. A paciente 1 é meia irmã dos pacientes 2 e 3, e prima da paciente 4.

Patiente 2 (III/2)

A paciente do sexo feminino foi introduzida aos 9 anos de idade e mostrou atraso no desenvolvimento e linguagem, bem como déficits intelectuais (K-ABC-Test: IQ 63). Um EEG desperto mostrou alterações gerais, mas até o momento não ocorreram convulsões. Seu OFC está entre P3 e P10, peso e altura estão na faixa de normalidade. O ADHD é tratado com metilfenidato. Ela é descrita como uma pessoa alegre, mas também agressiva e impulsiva e frequenta uma escola especial. Ambos os pais não estiveram disponíveis para mais investigações.

Patiente 3 (III/3)

A paciente de 10 anos foi diagnosticada com um distúrbio de aprendizagem, que não foi mais definido. As medidas do corpo da menina mostram uma grande variação no tempo. Até os 2 anos de idade, seu OFC era P<3; atualmente, seu peso é P97. Ela é obesa, apresenta comportamento estereotipado e freqüenta uma escola especial.

Patiente 4 (III/6)

O exame da paciente (13 anos de idade) revelou linguagem e atraso psicomotor, bem como leve déficit intelectual (HAWIK-IV: SW 56). As características notáveis são dislalia múltipla e TDAH, que é tratada com metilfenidato (10-15 mg/dia). O EEG do menino não é notável, o seu OFC é normal, a altura P90, e o seu peso P97. O caráter do paciente é descrito como amigável, mas às vezes agressivo e impulsivo. Ele frequenta uma escola para deficientes físicos. Ambos os pais frequentaram uma escola especial. O seu pai (II/5) está preso por agressão. Suas 2 irmãs (III/7, III/8) também estão visitando uma escola especial, e seu meio-irmão (III/9) mostra um atraso no desenvolvimento e na linguagem, mas não carrega a deleção. O paciente é primo dos pacientes 1, 2 e 3. Os pais não têm estado disponíveis para investigação.

Patiente 5

O paciente (14 anos de idade) apresentou comportamento social anormal e TDAH. Devido ao seu mau desempenho escolar e à discrepância entre seu desempenho intelectual (HAMIK-IV, QI 78) e a média da família, foi iniciado um exame médico. Após um ataque epiléptico, ele foi tratado com sucesso com Orfiril®. O ADHD é tratado com metilfenidato (5-10 mg/dia). Seus pais não estiveram disponíveis para investigação.

Patiente 6

Como um bebê, o paciente 6 manifestou atraso no desenvolvimento e na linguagem. Ele mostrou sinais de hipotonia. No momento do exame, o paciente de 19 anos apresentava déficits intelectuais e TDAH. O tratamento com metilfenidato foi interrompido depois que o paciente iniciou o esporte de alto rendimento, o que se mostrou um tratamento eficaz dos sintomas do TDAH. A mãe dele não é portadora de deleção. Seu pai não esteve disponível para investigação.

Patiente 7

O paciente foi examinado aos 7 anos de idade e revelou leves déficits intelectuais (K-ABC-Test, SW: 63). As medidas do seu corpo estão todas dentro do P10. Ele é descrito como inquieto e desatento. Ele frequenta uma escola especial. Seus pais não têm estado disponíveis para investigação.

Patiente 8

O paciente nasceu com uma deficiência cardíaca (defeito do septo ventricular e defeito do septo atrial). Apresenta características dismórficas, como orelhas baixas, hipertelorismo, estrabismo e hipotonia. O seu desenvolvimento psicomotor é retardado. A duração do nascimento e do OFC do paciente era de P50, seu peso era de P10. Ele herdou a duplicação de seu pai, que mostra um fenótipo pouco marcante. Um tio (no local materno) com epilepsia e hipertermia maligna foi relatado.

Análise do ponto de ruptura

Em estudos anteriores, a heterogeneidade do tamanho da deleção tem sido um tópico de interesse. Shinawi et al. assumiram FAM7A1/2 para funcionar como um ponto de quebra, enquanto Szafranski et al. suspeitaram que CHRNA7 e CHRFAM7A fossem responsáveis pela deleção recorrente no locus 15q13.3. Antonacci et al. sugeriram a família genética GOLGA8 como possíveis candidatos. Foi feita uma tentativa de validar estas teorias usando FISH. A sonda 4 marca CHRNA7, a sonda 5 marca FAM7A, a sonda 2 marca CHRFAM7A e a sonda 3 marca uma região distalmente a CHRFAM7A (fig. 1). Nos nossos pacientes, a FAM7A é detectável em ambos os cromossomas 15. Este achado indica que o ponto de quebra distal está localizado entre CHRNA7 e FAM7A. A análise dos pacientes 7 e 4 mostra que o ponto de parada proximal está localizado distalmente ao CHRFAM7A (figs. 3, 4). No paciente 7, a sonda 3 faz a ponte entre o ponto de ruptura. Portanto, CHRNA7 e CHRFAM7A não mediam a deleção recorrente em relação aos nossos pacientes.

Avaliação de Pacientes Sintomáticos Descritos em Estudos Anteriores

Para pacientes e estudos ver tabela 2 e material suplementar online 1 (para todo o material suplementar online, ver www.karger.com/doi/10.1159/000443343). A análise estatística foi realizada pelo teste exato da Fisher, usando o software ‘R’. Os resultados com p < 0,05 foram avaliados como significativos.

Discussão

A família que apresentamos mostra características interessantes. Por um lado, o grau de relacionamento varia; por outro, os sintomas também diferem (fig. 2). No entanto, não há uma ligação demonstrável entre o grau de relação e os sintomas. Os pacientes 2 e 3, que são irmãs, são notavelmente diferentes. Elas variam consideravelmente nas medidas corporais, no caráter e na gravidade dos sintomas, embora estejam expostas a fatores ambientais semelhantes e carreguem o mesmo tamanho de deleção. Portanto, outros fatores genéticos são obrigados a influenciar o grau de manifestações clínicas. Uma possível explicação pode ser uma expressão alterada dos seus genes no genoma, que pode ter efeitos diversos . Esta abordagem foi ainda mais confirmada por Henrichsen et al. , que mostraram que as regiões CNV são expressas em níveis mais baixos e variáveis e modificam a expressão dos genes vizinhos. Chaignat et al. afirmaram que os CNVs alteram o tempo de expressão dos genes durante o desenvolvimento em camundongos. Além disso, diferentes padrões temporais de expressão podem ser encontrados em diferentes indivíduos. Além disso, alterações na expressão ou mutações de diferentes genes que codificam diferentes etapas da mesma via neurobiológica podem intensificar os sintomas neurológicos. Poot et al. sugerem diferentes mecanismos que podem levar à pleiotropia fenotípica dos CNVs, por exemplo, a interação dos CNVs, epistasia genética ou exclusão alélica.

Três dos quatro membros da família manifestam TDAH; todos mostram atraso no desenvolvimento. Como a origem do TDAH aparentemente é multifatorial, não é surpreendente encontrar um acúmulo em uma família. Notavelmente, todas as crianças são afectadas pela eliminação. Constelações genéticas familiares particulares possivelmente aumentam a probabilidade de manifestação de sintomas. Além disso, o ambiente intra-uterino da mãe portadora da deleção pode ter afetado o fenótipo dos seus filhos. Entretanto, nenhum CNV compartilhado correlacionado com a ocorrência de sintomas pôde ser identificado, e nenhum segundo CNV patogênico pôde ser identificado em qualquer um de nossos pacientes.

A análise do ponto de parada mostra que o ponto de parada distal está posicionado distalmente ao CHRNA7. Possíveis localizações seriam dentro das famílias de genes FAM7A ou GOLGA8, como já foi sugerido, ou dentro das regiões de controle do locus. O ponto de parada proximal está localizado distalmente ao CHRFAM7A. Nos pacientes 1-4, que pertencem a uma família, os tamanhos de deleção detectados pelo software de análise aCGH são diferentes. Essas diferenças são causadas por lacunas no padrão de distribuição dos oligonucleotídeos no aCGH dentro e ao redor das regiões do ponto de parada. Pequenas mudanças na razão de log dos oligonucleotídeos marginalmente localizados resultam em uma mudança considerável do tamanho de deleção detectado pelo software de análise. A diferença óbvia no tamanho da deleção recorrente 15q13.3 é muito provavelmente um artefato do software de processamento. Nós assumimos que a deleção seja idêntica em tamanho para todos os membros da família (ver material online 2).

Diferentes estudos CNV revelaram uma associação do 15q13.3 microdeleção com esquizofrenia, epilepsia e autismo. Várias publicações têm sido publicadas apresentando novos casos e teorias sobre pontos de ruptura e fatores que alteram os sintomas . Esforços foram feitos para fundir essas informações a fim de encontrar novas conexões.

Os resultados deixam espaço para especulações. As exclusões são herdadas em 80,88%. O decente materno é descrito com maior freqüência para deleções (54,41%, p = 0,001) e duplicações (53,33%, p = 0,027).

Uma explicação pode ser dada por Sinkus et al. Eles estudaram o impacto dos polimorfismos promotores de CHRNA7, que diminuem o nível de transcrição pelo ∼25% e influenciam o nível de cortisol na mãe e no filho. O nível de cortisol da criança é reduzido ainda mais, se a mãe e a criança forem portadoras de polimorfismo. O impacto do ambiente intra-uterino também pode ter influência sobre outros fatores. O OFC é reduzido nos pacientes se a deleção for herdada pela mãe (P<25 em 50%, p = 0,002). Portanto, assumimos que se a aberração for herdada da mãe, o ambiente intra-uterino irá intensificar os sintomas. Como só incluímos pacientes sintomáticos nesta avaliação, isto explicaria porque a maioria das aberrações são aparentemente de origem materna (54%, p = 0,001). Neste contexto, é impressionante que a distribuição de gênero da deleção seja igual. Nossos dados confirmam os achados de Lowther et al. . Em sua revisão abrangente da deleção 15q13,3, eles combinaram pacientes sintomáticos e assintomáticos. Como só incluímos pacientes sintomáticos, as proporções dos padrões de distribuição das características são semelhantes, mas os números relativos diferem. Em relação ao aumento decente das deleções maternas, eles declaram uma redução da aptidão reprodutiva em homens como uma possível explicação.

O tamanho da deleção não se correlaciona consistentemente com o grau dos sintomas. Por exemplo, comparar o grau de déficit intelectual com o tamanho da deleção não mostra nenhuma conexão linear. Pacientes com a deleção típica de 1,6-Mb mostram déficits graves com mais freqüência do que pacientes com deleções menores ou maiores (41,07%, p = 0,00045). Déficits intelectuais são relatados significativamente mais frequentemente em pacientes com deleções do que duplicações (79,78 e 55,56%, p = 0,037). Como esperado, a inteligência normal é descrita com mais freqüência em pacientes com deleções <1 Mb (45%, p = 0,0037).

Deleções com tamanho de 1-1,6 Mb são mais freqüentes (63,21%, p = 0,0002). Duplicações <1 Mb (66,67%, p = 0,0004) são as mais frequentemente descritas. Em relação às deleções, déficits intelectuais (79,78%), distúrbios de linguagem (75,34%), um fenótipo notável dos pais (66,67%) e problemas comportamentais (63,64%) são descritos com muito mais freqüência do que epilepsia (30,61%) ou autismo (27,71%) (p = 0,02-3,931E-09). Comparando duplicações e deleções, as duplicações estão mais frequentemente associadas ao autismo (p = 0,039) e o fenótipo dos pais é visivelmente menos frequente (p = 0,027).

A epilepsia está significativamente associada a déficits intelectuais leves (59,09%, p = 0,0029). O distúrbio de linguagem está associado a déficits intelectuais em 79,24% dos casos (p = 0,003).

Para concluir, pode-se dizer que o fenótipo clínico da microdeleção 15q13.3 é de origem multifatorial. Mesmo os familiares próximos expostos a fatores ambientais similares diferem significativamente em suas manifestações clínicas. O aconselhamento genético em famílias com microdeleções 15q13.3 ou notadamente microduplicações permanece assim complexo e ocasionalmente inadequado. Outras investigações em alterações genéticas relativas às regiões alélicas ou promotoras dos genes afetados podem ser mais promissoras quando se trata de descobrir fatores influenciadores.

Acreditativos

Os autores agradecem a Margot Fliegauf, Monika Heinkelein, Helga Heitzler e Claudia Ladwig do grupo citogenético do Instituto de Genética Humana de Friburgo pelo aconselhamento e assistência experimental. Agradecemos também a Ekkehart Lausch, Elke Botzenhart, Susanne Munk-Schulenburg, e Andreas Busche pelo cuidado com os pacientes. Agradecemos aos pacientes e seus familiares pela sua amável cooperação.

Declaração de Ética

Os autores não têm conflitos éticos a revelar.

Declaração de Divulgação

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

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