Both desnaturada e nativa BR pode se ligar ao GroEL
Central ao mecanismo de atividade GroEL é sua capacidade de reconhecer uma gama diversificada de polipéptidos principalmente através de interações entre os resíduos hidrofóbicos do substrato e helices H e I nos domínios apicais GroEL (Fig. 1A) (Coyle et al. 1997). Aqui, a ligação do BR desnaturado e nativo ao GroEL foi primeiramente examinada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC), uma vez que cada estado tem resíduos de superfície hidrofóbicos abundantes que são facilmente acessíveis ao GroEL. Como mostrado na Fig. 2A, a titulação de GroEL com BR produz termogramas de titulação exotérmica em ambos os casos. As mudanças de calor são devidas especificamente à ligação do BR à GroEL como injeção consecutiva de BR nos tampões do ensaio sem a chaperonina produz termogramas planos (suplemento Fig. S1). O calor de cada injeção mostrada na Fig. 2A foi integrado, corrigido pelo calor de diluição, e foi plotado contra a razão molar de BR: GroEL (Fig. 2B). A mudança de calor se encaixa em um conjunto de locais de ligação do modelo (curvas vermelha e azul), produzindo uma constante de dissociação (Kd) próxima a 0,3 nmol/L para BR desnaturado e próxima a 6,0 nmol/L para BR nativo, respectivamente (Tabela 1). Assim, a desnaturação do BR aumentou a afinidade de ligação de GroEL para esta proteína de membrana em uma ordem de grandeza. Por outro lado, a ligação de qualquer das amostras de BR é impulsionada pela mudança favorável de entalpia (ΔH) e oposta pela mudança negativa de entropia (ΔS); a estequiometria de ligação (N) determinada em ambos os casos está próxima da unidade (Tabela 1). Entretanto, a ligação do BR nativo é claramente menos entalpica com menor compensação de entropia.
A ligação do BR à GroEL avaliada pelo ITC. Uma titulação do GroEL com BR desnaturado em SDS (dBR, vermelho) ou BR nativo (nBR. azul). Os termogramas foram registrados a 20 °C com um instrumento MicroCal ITC200. B A troca de calor de cada injeção em A foi integrada e plotada contra a razão molar BR:GroEL. As linhas sólidas representam o ajuste dos dados a um único modelo de conjunto de locais (todos os locais idênticos e equivalentes) e os parâmetros termodinâmicos obtidos estão listados na Tabela 1
A co-conferência em forma de tampa de GroES é um componente essencial na dobragem da proteína mediada por GroEL em bactérias, e demonstrou partilhar os mesmos locais de ligação em GroEL com o substrato (Chen e Sigler 1999). A titulação do GroEL com BR desnaturado na presença do GroES indica que o GroES tem pouco efeito na ligação do BR (figura suplementar S2 e tabela 1). Este resultado pode ser compreendido levando em conta Kd, que para a formação de um complexo GroEL/ES foi previamente determinado como sendo 3 μmol/L e é significativamente maior que o do complexo BR-GroEL aqui determinado (Behlke et al. 1997). Isto indica uma interação muito mais fraca das duas proteínas chaperonin e, portanto, consistente com o efeito insignificante. Entretanto, na presença do ATP, que regula os ciclos de ligação e liberação de GroEL e GroES in vivo, a afinidade de GroEL/ES aumentaria três ordens de magnitude (normalmente Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), teoricamente capaz de competir com a ligação de BR a GroEL. O efeito do apoGroEL na dobra de BR e, em seguida, o papel de GroES e ATP nesse processo foram posteriormente investigados.
Sistema GroEL-GroES pode modular a dobra de BR na presença de DDM
Uma porção de BR desnaturado com SDS foi observada para redobrar quando diluído com um excesso de detergente solubilizante n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), como revelado pela medição da recuperação da absorção da retina (suplemento Fig. S3) (Booth 1997). Nenhuma recuperação significativa foi detectável no tampão de ensaio sem detergente ou suplementado apenas com GroEL. No entanto, na presença do DDM, a adição de GroEL mostrou um efeito óbvio na dobra de BR (suplementar Fig. S3). A taxa constante para o GroEL (0,15 μmol/L) – dobramento mediado, como avaliado pelo encaixe com cinética exponencial única, foi estimado em ~dois vezes menor do que o dobramento espontâneo. Sabe-se que o GroEL normalmente retarda a dobragem de proteínas solúveis que podem dobrar eficientemente na sua ausência. Isto foi explicado através de uma competição entre a dobra intramolecular e a ligação intermolecular a GroEL (Gray and Fersht 1993; Itzhaki et al. 1995). Parece inteiramente plausível que GroEL se comporte de forma similar na dobra de BR desnaturada. Quando a concentração de GroEL foi aumentada para 0,30 μmol/L, a constante de taxa estimada não mudou obviamente, enquanto que o rendimento da dobra atingiu um nível muito maior do que a dobra espontânea após 60 min (Fig. S3 suplementar). Estes dados demonstram que o apoGroEL pode diminuir a taxa de dobramento BR mas aumentar o rendimento da proteína dobrada.
Porque as células bacterianas contêm vários milimolares de ATP e em condições normais, a razão molar relativa de GroES versus GroEL é 1,9 e após o choque térmico 4,7 (Moparthi et al. 2013); é improvável que GroEL permaneça por muito tempo sem a ligação de ATP e GroES. Na presença de ATP (azul na Fig. 3A), a recuperação do BR corretamente dobrado foi significativamente mais rápida e maior em comparação com o apGroEL sozinho ou com o processo espontâneo (vermelho e preto na Fig. 3A). Em contraste, a combinação de GroEL e GroES mostrou pouco efeito na taxa de dobra espontânea, mas reduziu o rendimento até certo ponto (Fig. 3A, ciano). Isso indica uma interação entre GroEL e GroES sem exigência de ATP, provavelmente induzida pelo BR ligado a GroEL, o que por sua vez teve um efeito adverso na recuperação da proteína dobrada corretamente. Quando o sistema completo de chaperonin foi utilizado (Fig. 3A, verde), observou-se um aumento da taxa máxima, mas o rendimento de dobra caiu entre os dois casos anteriores.
Curso temporal de dobra de BR modulado pelo sistema GroEL-GroES dependente de ATP. A A recuperação do BR dobrado foi continuamente monitorada com absorvância a 554 nm. As seguintes adições foram feitas: nenhuma (preto); 0,3 μmol/L GroEL (vermelho); 0,3 μmol/L GroEL e 5 mmol/L ATP (azul); 0,3 μmol/L GroEL e 0,6 μmol/L GroES (ciano); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES e 5 mmol/L ATP (verde). B A dobragem líquida GroEL-mediated BR foi realizada primeiro; depois, em T = 60 min, a amostra foi suplementada apenas com ATP, apenas com GroES, ou com ambos como indicado. C Para a comparação com A, foi também analisado o efeito da versão sem ciclagem de anel único (SR1) da GroEL na dobragem em BR. As concentrações de SR1, GroES e ATP utilizadas foram de 0,6 μmol/L, 1,2 μmol/L, e 5 mmol/L, respectivamente. D Os efeitos de GroEL/ES mais ATP na dobra nativa do BR foram examinados seguindo a mudança de absorvância a 560 nm. As concentrações de chaperonin e nucleotídeo utilizadas em B e D foram as mesmas que em A. BR foi mantido em 2,4 μmol/L em todas as experiências. As linhas azul e verde em A e a linha azul em C representam o ajuste dos dados à equação exponencial trifásica, enquanto as linhas restantes são o ajuste com uma única equação exponencial. Todas as linhas em B e D são guias simples para os olhos
Os resultados acima indicam que ATP e GroES podem influenciar a dobra do BR mediado por GroEL de uma maneira diferente. A ligação do GroES à GroEL é um pouco prejudicial para a dobragem, em contraste com o conhecido papel positivo do encapsulamento do substrato na gaiola GroEL/ES para a dobragem assistida (Jewett e Shea 2010). A seguir questionamos como este efeito adverso foi produzido. Intrigantemente, o GroES sozinho ou sua seqüência de laço móvel através da qual o GroES se liga ao GroEL também facilitou a recuperação do BR dobrado (Fig. S4 suplementar). Além disso, a sequência de laçadas mostrou um efeito semelhante ao GroES na dobra mediada por GroEL na ausência e presença de ATP (suplementar Fig. S4). Embora não possa formar uma tampa selada acima da cavidade central de GroEL como GroES, implicando uma contribuição significativa da interação loop-GroEL para a dobra. Notavelmente, os resíduos hidrofóbicos na superfície apical do GroEL envolvidos na ligação do laço móvel GroES sobrepõem-se, na sua maioria, àqueles envolvidos na ligação da proteína do substrato (Motojima et al. 2000). É improvável que o BR hidrofóbico tenha sido deslocado e liberado na gaiola hidrofílica GroEL/ES pelo laço móvel, especialmente dada a presença de micelas DDM fora da gaiola, o que favoreceria ainda mais a dobra ou solubilização do BR. De preferência, como demonstrado para a dobra assistida de várias proteínas solúveis (Motojima e Yoshida 2010), o BR pode ser capturado próximo à interface GroEL/ES, parcialmente protuberante para fora quando todo o sistema ou mesmo GroEL/ES sozinho foi utilizado neste estudo. Tal interação pode impedir o BR de acessar as micelas DDM favoráveis, resultando na redução do rendimento de dobra observada tanto com GroES quanto com seu loop móvel.
No entanto, alguns estudos sugerem que o papel de ATP e GroES é apenas o de dissociar substratos pegajosos (ou seja, com um Kd na região nmol/L determinada aqui), o que limita a taxa de dobra assistida ou mesmo inibe a atividade de dobra de GroEL se não for removido (Priya et al. 2013). Para testar se GroES e ATP apresentam um efeito semelhante na dobra assistida do BR, primeiro incubamos o apoGroEL com BR desnaturado durante 60 min.; depois, adicionamos GroEL ou/e ATP (Fig. 3B). A posterior adição de ambos os componentes promoveu ainda mais a dobra do BR, mas foi menos eficaz do que a adição simultânea de ambos, demonstrando sinergia entre os dois para ajudar a dobra mediada pelo GroEL. As medidas de anisotropia com peptídeos transmembrana de BR, que foram utilizados como miméticos para o BR desnaturado para contornar as complicações introduzidas pela natureza dinâmica do BR desnaturado e das interações GroEL-BR, mostraram que apenas a combinação de ATP e GroES foi capaz de separar eficientemente o complexo peptídeo-GroEL pré-formado (Fig. S5 suplementar). Assim, parece que tanto GroES quanto ATP são necessários para dissociar os conformadores BR de alta afinidade e regenerar os locais de ligação (ou catalítico) GroEL estagnados.
Para examinar mais detalhadamente o efeito de GroES e ATP na dobra do BR mediado por GroEL, usamos um mutante GroEL de anel único (SR1) que forma um complexo estável com GroES (Weissman et al. 1995), em contraste com o sistema de ciclagem GroEL-GroES. Similar à nossa observação com GroEL, ATP aumentou a taxa e o rendimento da dobra mediada por SR1 (azul na Fig. 3C), enquanto a presença de GroES reduziu consideravelmente ambos os aspectos (ciano) quando comparado ao caso com apoSR1 sozinho ou o processo espontâneo (vermelho ou preto). Como o BR desnaturado foi determinado pelo ITC para ligar-se ao SR1 com uma estequiometria próxima à unidade (fig. suplementar S2), e o SR1 utilizado foi o dobro da concentração de GroEL, especula-se que se formaram mais complexos BR-SR1 do que BR-GroEL, onde GroES exerceu maior influência na dobra (ciano). Como esperado, a adição de ATP e GroES mostrou um efeito insignificante na recuperação de BR (verde), atribuível à ligação irreversível de GroES a SR1 na presença de ATP (Weissman et al. 1995). Além disso, este resultado indica que o aumento da taxa máxima observada com GroEL é devido aos múltiplos ciclos de ligação e liberação de GroES regulados por ATP.
GroEL sozinho ou em combinação com ATP ou/e GroES mostrou influência insignificante na estrutura do BR nativo solubilizado com DDM (Fig. 3D), apontando para uma interação intramolecular mais forte dentro da proteína nativa do que a ligação intermolecular com GroEL. Assim, a transição do BR mediado por chaperonina do estado desnaturado metastable para o estado nativo é termodinamicamente favorável.
Avidência tanto para a desagregação mediada por chaperonina quanto para o desdobramento
A medição da dobra espontânea do BR em concentrações variadas demonstra que a agregação resultou em recuperação apenas parcial do BR dobrado corretamente e que a taxa aparente foi independente da concentração, implicando que a agregação foi irreversível (Fig. S6 suplementar). Na ausência do detergente solubilizante DDM, o BR desnaturado com SDS foi estimado pela espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) como tendo um coeficiente de difusão (~67 μm2/s) muito menor do que o ligado ao GroEL (~104 μm2/s) (Fig. 4). Isso reflete que os agregados formados pelo BR desnaturado são ainda maiores que o complexo BR-GroEL com uma estequiometria de ligação próxima à unidade, conforme determinado pela ITC. Isto também significa que o GroEL foi capaz de romper a estrutura de agregação, bombeando essencialmente a via de dobramento produtivo com BR monomérico. Além disso, o nBR solubilizado com DDM foi determinado como tendo um coeficiente de difusão de ~117 μm2/s, que é maior que o do dBR com GroEL e muito maior que o do dBR sozinho (Fig. 4). Isto sugere que nBR foi bem disperso na presença de DDM e também apóia a idéia de desagregação de dBR mediada por GroEL. Além disso, quando o sistema completo de chaperonin foi adicionado ao BR desnaturado, os precipitados floculentos brancos foram imediatamente visíveis (dados não mostrados), indicando desdobramento forçado, bem como sinergismo entre GroES e ATP neste aspecto. Sem detergentes solubilizantes ou lipídios que imitam as membranas biológicas na solução a granel, o BR desdobrado agregaria e precipitaria instantaneamente, em contraste com o aumento significativo da taxa de dobramento observado na presença de DDM.
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FCS medida do BR desnaturado na ausência ou presença de GroEL em comparação com o BR nativo. As amplitudes de autocorrelação de fluorescência G(τ) do Alexa Fluor 488 foram mostradas para BR desnaturado SDS sozinho ou com excesso de GroEL na ausência de detergente solubilizante ou BR nativo solubilizado com DDM. Os coeficientes de difusão (D) foram obtidos ajustando a curva de autocorrelação com Eq. 1. Os desvios padrão foram de três medidas independentes
Inserção de BR mediada por GroEL-GroES
Para determinar se ou como GroEL-GroES suportaria a integração de BR no bocal, foram preparadas vesículas de membrana citoplasmática invertida (IMVs) a partir de Escherichia. Células coli e misturadas com BR desnaturado na presença e ausência de apoGroEL, ou mais ATP/GroES (Fig. 5A). O ApoGroEL causou uma alteração insignificante na recuperação do BR corretamente dobrado em IMVs, medido pela espectroscopia UV-Vis (preto e vermelho). Diferente da dobra em micelas DDM, a adição de GroEL e ATP mostrou ser prejudicial à inserção da membrana (azul), enquanto GroEL combinado com GroES facilitou este processo (ciano). A verdadeira razão para esta diferença reprodutível não é conhecida, mas a rigidez dos IMVs e a mudança estrutural do GroEL-bound BR induzida pela ligação ATP ou GroES podem ser razões possíveis. Especificamente, sabe-se que a ligação ATP pela GroEL causa uma expansão da abertura da cavidade da acompanhante (Skjaerven et al. 2015). Esta mudança é mais apreciável do que aquela causada pela simples ligação de GroES a GroEL (Kim et al. 2005), permitindo assim possivelmente o desdobramento do substrato ligado (Lin et al. 2008; Sharma et al. 2008), favorável à dobra produtiva em um solvente apropriado. Entretanto, ao contrário das micelas DDM que são altamente dinâmicas, os IMVs provavelmente não foram capazes de proteger prontamente as espécies de BR desdobradas e fornecer oportunamente um microambiente dobrável vantajoso. Em comparação, a fraca associação do GroES com o GroEL na ausência do ATP poderia entregar BR aos IMVs preparados de uma forma mais eficiente. Entretanto, similar à redobramento em micelas DDM, o sistema completo GroEL-GroES melhorou muito a inserção da membrana do BR (verde), que atingiu um estado estável rapidamente com a quantidade de BR recuperado caindo entre os dois casos anteriores.
>Inserção do BR nos IMVs mediados pelo sistema GroEL-GroES. Uma inserção e/ou redobramento do BR desnaturado (2.4 μmol/L) em IMV foram continuamente monitorados com absorvância a 554 nm. As seguintes adições foram feitas: nenhuma (preto); 0,3 μmol/L GroEL (vermelho); 0,3 μmol/L GroEL e 5 mmol/L ATP (azul); 0,3 μmol/L GroEL e 0,6 μmol/L GroES (ciano); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES e 5 mmol/L ATP (verde). B Native BR pode ser transferido eficientemente para IMVs na presença de GroEL com a ajuda de ATP e GroES. As concentrações testadas de BR nativo, GroEL, GroES e ATP foram 0,4, 5, 10 μmol/L, e 5 mmol/L, respectivamente
Nextra, a anisotropia de fluorescência foi empregada para sondar os efeitos das chaperoninas bacterianas na inserção do BR em IMVs (Fig. 5B). Quando o BR nativo fluorescentemente rotulado foi misturado com uma quantidade excessiva de GroEL, a anisotropia mudou para um valor maior, demonstrando que a proteína da membrana formou um complexo estável com a chaperonina. É importante ressaltar que a adição posterior de IMVs levou a um aumento adicional da anisotropia, indicativo da integração do BR aos IMVs. Verificou-se que o ATP e o GroES melhoraram ainda mais a transferência do BR para a membrana, a julgar também pelo aumento da anisotropia. Estes resultados aumentam a perspectiva de que GroEL, juntamente com GroES e ATP, pode ter um papel direto na integração de proteínas no bocal lipídico in vivo.