Imprimir a solubilidade das proteínas recombinantes usando o MBP tag

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E. coli expression

Gerar proteína recombinante requer o uso de um hospedeiro de expressão e a E. coli é geralmente a melhor escolha para este propósito. Uma combinação de genética simples, facilidade de cultivar, expressão rápida e altos rendimentos faz dela um hospedeiro atraente, enquanto a falta de um maquinário pós translacional eficiente, o viés de uso do códon e a dificuldade em produzir proteínas de maior peso molecular, a torna desvantajosa. Contudo, um dos maiores males da expressão da E.coli é a expressão insolúvel – o fenómeno em que a sobreexpressão recombinante resulta na formação de agregados proteicos insolúveis chamados de corpos de inclusão.

Formas de lidar com corpos de inclusão e melhorar a solubilidade da proteína alvo

Quando os corpos de inclusão se formam, os cientistas normalmente tentam um processo complicado chamado solubilização e redobramento da proteína in vitro para recuperar a proteína solúvel ou tentam a otimização da expressão a nível de processo ou molecular para prevenir problemas de insolubilidade. Por exemplo, otimização das condições de expressão, ajuste das condições de crescimento e indução, mudança de meio, buffers, etc. Uma alternativa seria experimentar uma abordagem molecular e manipular a proteína alvo, eliminando elementos indesejáveis dentro de sua seqüência, criando truncamentos ou mutando certos aminoácidos para tornar a proteína mais solúvel. Você também poderia adotar uma abordagem racional de mutagênese direcionada ao local, baseada em informações estruturais ou adotar uma abordagem de evolução direcionada e triagem para a solubilidade de mutantes de pontos aleatórios, deleções e fragmentos. Uma abordagem melhor e mais fácil seria adotar uma estratégia de parceiro de fusão e usar um parceiro de fusão a montante que tornaria a proteína alvo mais solúvel.

A abordagem de parceiro de fusão para melhorar a solubilidade da proteína

Usando esta abordagem, uma proteína ou peptídeo de difícil expressão é fundida com outra proteína, estável e altamente solúvel, a fim de estabilizar a expressão, com a idéia de que a proteína de fusão irá impulsionar a expressão resultante. Embora muitas proteínas sejam altamente solúveis, elas não são todas eficazes como potenciadores da solubilidade da proteína. Nesse sentido, a Proteína de Ligação de Maltose pode ser um parceiro muito útil na solubilidade da proteína. Em um estudo comparativo para investigar suas propriedades de aumento da solubilidade proteica, a etiqueta E. coli MBP provou ser um parceiro de solubilidade proteica muito mais eficaz do que as proteínas Glutathione-S-transferase (GST) e Thioredoxin (TRx).

Figure 1: GenScript scientific recommendation regarding construct design

Sobre o tag MBP e seu mecanismo de ação

MBP é uma proteína de aproximadamente 42 kDa, que ocorre naturalmente na E. coli, codificada pelo gene MalE, que é responsável pela absorção, degradação e transporte da maltodextrina, um carboidrato. Originalmente desenvolvida como um tag de expressão de proteínas nos anos 80, é conhecida por aumentar significativamente a solubilidade de uma variedade de proteínas alvo, fundidas a jusante. Embora o mecanismo exato do aumento da solubilidade das proteínas pela etiqueta MBP não seja claro, sabe-se que estabiliza e protege a proteína do passageiro a jusante da degradação proteolítica durante e após a síntese protéica. Os rendimentos citoplasmáticos das proteínas MBP fundidas também são normalmente mais elevados porque a proteína de fusão fornece contextos confiáveis para o início eficiente da translação. Também é proposto que o tag MBP pode agir como um chaperone por interações através de um ponto quente exposto a solvente em sua superfície que estabiliza a proteína de passageiro insolúvel.

O uso do tag MBP

Embora o tag MBP fusionado ao N-terminus ou C-terminus tenha mostrado aumentar a expressão solúvel recombinante, uma abordagem comum é fundi-lo ao N-terminus. Infelizmente, como nenhuma tag pode ser ideal para todas as aplicações, para aumentar a versatilidade das tags e aplicações downstream, métodos de marcação combinatória foram desenvolvidos para várias necessidades. Duas marcas de afinidade expressas em conjunto com um local de clivagem protease que precede a proteína alvo, permitem a utilização de múltiplas estratégias de purificação. Ao incorporar uma etiqueta que aumenta a solubilidade em combinação com uma etiqueta de purificação, são conseguidas melhorias na solubilidade da proteína e nos rendimentos de expressão, bem como métodos para uma purificação eficiente

Figure 2: Um esquema geral para a estratégia de desenho da construção – combinação de etiqueta de afinidade/solubilidade no sítio de clivagem proteolítica N-terminus seguida pela proteína alvo pode dar bons resultados, especialmente para proteínas alvo insolúveis. Uma sequência de linker pode muitas vezes ajudar em questões de clivagem proteolítica.

Purificação das proteínas marcadas com MBP

Além do aumento da solubilidade da proteína, outra vantagem de usar uma estratégia de fusão de MBP é facilitar a purificação da proteína alvo a jusante. A MBP é uma etiqueta de afinidade natural que se liga à resina amilose e pode ser utilizada para a purificação por afinidade em uma única etapa, ligando-se à amilose reticulada. As proteínas recombinantes fundidas com etiquetas MBP ligadas à amilose imobilizada são tipicamente eluídas sob condições de não desnaturalização utilizando maltose .

Desvantagens desta estratégia

• A clivagem da proteína alvo pode ser um problema devido ao impedimento estéreo do MBP tag
• A resina amilose pode ser frágil e relativamente cara
• Precipitação da proteína alvo após a clivagem
• algumas proteínas de fusão MBP não se ligam eficientemente à resina amilose e mesmo quando se ligam, Os rendimentos podem ser um problema

Conclusão

Embora não exista uma solução simples e global para resolver os problemas de insolubilidade em E.coli, uma construção bem concebida e uma estratégia de expressão cuidadosamente elaborada pode dar-lhe a proteína solúvel desejada. MBP é uma etiqueta de solubilidade confiável para a produção de proteína solúvel recombinante e, embora a solubilidade seja um dos elementos mais importantes de uma campanha de produção de proteína, o objetivo final não deve ser sempre sobre solubilidade. Níveis de expressão, atividade proteica, pureza, homogeneidade e estabilidade são fatores importantes que também devem ser levados em consideração antes de iniciar uma campanha de produção de proteínas recombinantes.

Poucas publicações que demonstram a utilidade da etiqueta MBP

>	Produção de Fusokines usando MBP -Maltose-A fusão de proteínas de ligação permite a expressão de alto nível bacteriano e a purificação de derivados bioativos de citocinas de mamíferos (setembro de 2014)

O resgate da agregação-Proteínas propenso usando MBP -Rescuing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (Maio 2014)

MBP para produção de proteínas solúveis em E. coli -Hexahistidina como parceiro de fusão para a produção de proteínas recombinantes solúveis em Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A, e Leiting, B. (1997). Expressão de alto nível de proteína solúvel em Escherichia coli usando um sistema de fusão de dupla afinidade de proteínas His6-tag e ligação de maltose. Expr. proteico. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. and Waugh, D. S. (2002). Efeitos diferenciais das etiquetas de afinidade suplementares na solubilidade das proteínas de fusão MBP. J. Estrutura. Diversão. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., and Waugh, D. S. (2005) Gateway vectors for the production of combinatorially tagged His6-MBP fusion proteins in the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Melhoria da expressão das proteínas solúveis através do uso de etiquetas de fusão. Curr Opin Opinião Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Página R: Estratégias para maximizar a expressão da proteína heteróloga na Escherichia coli com custo mínimo. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Expressão e purificação do primeiro domínio de ligação de nucleotídeos e região de ligação do produto genético multirresistência humana: comparação de fusões com glutationa S-transferase, tioredoxina e proteína de ligação de maltose. Biochemical Journal 1999, 77-81
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