Introdução
Existem aproximadamente 10.000 espécies de micróbios nomeados. Estima-se que existam entre 10.000 e 100.000 espécies mais não identificadas para cada uma delas. Não só existem muitos tipos de bactérias, como também existem muitas bactérias individuais. Uma única colher cheia de solo pode ter 100 milhões de bactérias individuais. Uma raspagem das gengivas pode produzir 1 milhão de bactérias por cm2 (um cm2 é aproximadamente do tamanho da sua unha pequena). As bactérias no e sobre o nosso corpo constituem cerca de 10% do nosso peso corporal seco.
A maior parte das espécies de bactérias actualmente conhecidas foram identificadas utilizando técnicas microbiológicas tradicionais, tais como a reacção de coloração grama, morfologia e reacções metabólicas. As bactérias raramente vivem sozinhas, mas em comunidades com outras bactérias. Isto é verdade tanto no ambiente como no e sobre o nosso corpo. Esta aula foca o papel das bactérias nas doenças. O isolamento de uma única espécie bacteriana é o primeiro passo para identificar as bactérias possivelmente responsáveis por um processo de doença.
O primeiro requisito para isolar fisicamente uma bactéria é que ela possa ser cultivada em laboratório. Isto requer conhecimento da temperatura óptima para o crescimento, das necessidades óptimas de oxigénio e das necessidades nutricionais óptimas. Nós trabalhamos com um número muito limitado de bactérias neste curso. As bactérias com as quais trabalhamos também são muito fáceis de cultivar no laboratório. A maioria das bactérias não são tão agradáveis!
Existem duas formas principais de isolar organismos.
- Deslizamento para isolamento numa placa de ágar
- O método de placa de ágar
Deslizamento para isolamento numa placa de ágar envolve a diluição sucessiva de organismos até que as células tenham uma densidade suficientemente baixa para que as células únicas sejam fisicamente isoladas espacialmente para dar origem a colónias individuais reconhecíveis. No método de verter placa, dilua a sua amostra suficientemente antes de a adicionar ao ágar refrigerado fundido e depois verta esta mistura num prato. As células isoladas dão origem a colónias individuais que crescem no próprio ágar. Esta técnica pode ser um pouco complicada. Se o ágar derretido estiver demasiado quente, matas todas as bactérias. Se o ágar derretido estiver muito fresco, você acaba com um grande caroço na sua placa de Petri. O método de estrias produz colônias individuais na superfície do ágar. Esta técnica é muito mais rápida e fácil de dominar.
Overview
Você receberá uma amostra de caldo contendo três organismos, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens, e Escherichia. coli.
Todos os três organismos crescem prontamente aerobicamente em ágar de soja triptico (TSA). No entanto, o S. marsescens só forma um pigmento vermelho a 35°C ou menos e de forma ideal à temperatura ambiente (25°C). Cresce muito rapidamente a todas as temperaturas em colónias de tamanho médio.
E. coli tem uma aparência bronzeada a todas as temperaturas e é também um cultivador rápido que forma grandes colónias.
S. xylosus tem uma aparência amarelo-laranja a todas as temperaturas, cresce rapidamente, e forma colónias de tamanho médio a grande.
A sua capacidade de isolar e ver os três organismos na sua placa depende de condições de incubação apropriadas. As suas placas serão incubadas à temperatura ambiente durante 48 horas. Deve ser capaz de identificar os três organismos com base no tamanho da colónia e pigmento.
Materiais
- 1 cultura mista em caldo de soja triptico (TSB) tubo contendo Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens, e Escherichia. Coli (todos BSL2)
- 3 placas de TSA
Procedimento de Isolamento
Existem vários métodos de estrias para isolamento. A grande maioria dos nossos alunos tem tido mais sucesso com o método de estrias em quadrante que é descrito abaixo.
- Label a sua placa com o seu nome, data, secção e organismo.
- Utilizar procedimentos BSL2 para obter um loop-full de organismos do seu tubo de caldo de soja triptico (TSB). Consulte o protocolo da técnica asséptica.
- Certifique-se de ter misturado adequadamente o seu tubo de caldo para que os organismos fiquem uniformemente suspensos no caldo.
- Recapte o seu tubo TSB.
- Você pode fazer a próxima parte com a sua placa na bancada do laboratório ou segurando-a na sua mão. Você decide qual funciona melhor. Arraste ligeiramente o seu laço para a frente e para trás através da superfície do ágar. (Veja a Figura 1.)
- Quanto mais você arrasta, mais bactérias você deposita.
- A idéia geral é diminuir a concentração bacteriana com cada deslize.
- Quatro a cinco ziguezagues parece funcionar bem.
- Experimentar com suas diferentes placas. Não se esqueça de manter um registro do que você fez em cada placa.
- Se você estiver usando um incinerador, esterilize seu laço. Se você estiver usando laços de plástico, descarte seu laço usado no recipiente de cavicida e obtenha um novo laço de plástico estéril.
- Não volte para o tubo de caldo original.
- Toque seu laço na superfície de ágar contra a extremidade mais distante de sua primeira etapa. Repita arrastando para trás e para a frente.
- o Não arraste para o centro do seu prato.
- o Você deve ser capaz de ver os traços fracos da sua linha de estrias na superfície de ágar.
- Usando um laço estéril, repita o procedimento na sua segunda estria.
- Usando um laço estéril, repita o procedimento na sua terceira estria. Ziguezague a última parte para o centro da placa.
- Você deve terminar com colônias isoladas em algum lugar na sua última etapa.
- Se você estiver usando um incinerador, esterilize o seu loop. Se estiver a utilizar laços de plástico, deite fora o laço utilizado no recipiente de cavicida.
- Substitua a tampa da placa.
- Coloque as placas completadas em ágar no lado de cima do suporte de incubação, na secção da incubação.
Figure 1: Método quadrante de estrias para isolamento.
Notas
- É absolutamente essencial que você esterilize seu laço entre cada estria, seja usando o incinerador ou obtendo um novo laço plástico estéril. Este é o erro mais comum que os alunos cometem.
- Não deixe sua placa aberta por muito tempo ou bactérias extras do ambiente cairão em sua placa.
- Não fique desapontado se você não conseguir colônias isoladas em sua primeira tentativa. Este é um procedimento difícil.