Mecanismos de resistência às fluoroquinolonas e carbapenêmicos em Pseudomonas putida

Abstract

Objectivos: A Pseudomonas putida é um patógeno oportunista incomum, geralmente suscetível a agentes antimicrobianos. Dados relativos à resistência a agentes antimicrobianos em isolados clínicos de P. putida são limitados.

Patientes e métodos: Susceptibilidades a fluoroquinolonas, carbapenêmicos e outros antibióticos foram caracterizados em cinco isolados clínicos de P. putida recuperados de diferentes pacientes com infecções do trato urinário como patógenos causadores. Fluoroquinolona e resistência a carbapenem foram caracterizadas geneticamente pelos métodos de PCR e sequenciamento de DNA. Os perfis da proteína de membrana externa (OMP) foram caracterizados pela SDS-PAGE.

Resultados: Quatro dos cinco isolados foram resistentes ou intermediários às fluoroquinolonas e aos carbapenêmicos. Seqüências de nucleotídeos nas regiões determinantes da resistência às quinolonas sugeriram que mutações de aminoácidos como Thr-83→Ile em GyrA e Glu-469→Asp em GyrB podem contribuir para a alta resistência às fluoroquinolonas. Quatro isolados produtores de metallo-β-lactamase que mostraram resistência aos carbapenêmicos transportaram os genes da metallo-β-lactamase do tipo IMP. Um efeito combinado de produção reduzida de 46 kDa OMP e produção de metallo-β-lactamase foi mostrado por um isolado de P. putida exibindo a maior MIC de carbapenems.

Conclusões: Este estudo identificou mecanismos de resistência a fluoroquinolonas e carbapenêmicos em isolados clínicos de P. putida.

Introdução

Pseudomonas putida, um bacilo Gram-negativo não fermentador, é um patógeno humano oportunista responsável por bacteremia e sepse em pacientes neonatais, neutropênicos e com câncer, bem como infecções do trato urinário (IU).1-4 Embora incomum, a P. putida pode ser uma causa de infecções nosocomiais em hospedeiros comprometidos.3

A maioria dos P. putida é suscetível a agentes antimicrobianos como carbapenêmicos, fluoroquinolonas e aminoglicosídeos.5-7 No entanto, isolados clínicos de P. putida que produzem metallo-β-lactamases conferindo resistência a β-lactams, incluindo carbapenêmicos, foram relatados.3,4,8,9 Além disso, foram relatados recentemente isolados produtores de metallo-β-lactamas que mostraram resistência à ciprofloxacina, gentamicina e tobramicina, além de β-lactams.3 O aparecimento de P. putida resistente a múltiplas drogas tornou-se uma causa de dificuldade no tratamento de infecções e representa um risco de transmissão nosocomial.

Em alguns estudos anteriores, a resistência a antibióticos em P. putida tem sido caracterizada com respeito à produção de metallo-β-lactamases e características dos sistemas efluxantes.3,4,8-12 Os sistemas de P. putida resistentes a Carbapenem produzem com frequência lactamases metallo-β do tipo IMP e VIM, segundo relatórios da Europa, Coreia e Japão.3,4,8,9,9a Os sistemas Efflux como o TtgABC, MepABC, TtgDEF e ArpABC também podem contribuir para a resistência a múltiplas drogas em P. putida.10-12Pseudomonas aeruginosa tem a capacidade de se tornar rapidamente resistente durante o tratamento,13 embora não esteja claro se P. putida tem o mesmo potencial. Para avaliar os riscos de surgimento de resistência a antibióticos, são necessários dados abundantes sobre a resistência a agentes antimicrobianos nos isolados clínicos de P. putida. Neste estudo, nós determinamos suscetibilidades a agentes antimicrobianos incluindo fluoroquinolonas e carbapenêmicos e caracterizamos mecanismos de resistência a fluoroquinolonas e carbapenêmicos, em isolados clínicos de P. putida recuperados como patógenos causadores de IU durante um período de 1 ano em nosso hospital.

Patientes e métodos

Patientes

Cinco pacientes (quatro homens e uma mulher) diagnosticados com IUs agudas, repetidas ou crônicas causadas por P. putida. putida no Hospital Universitário Hamamatsu foram incluídos em nosso estudo de outubro de 2001 a setembro de 2002.

Estirpes bacterianas e métodos microbiológicos

Estirpes utilizadas neste estudo foram cinco isolados clínicos de P. putida recuperados de diferentes pacientes como patógenos causadores. A identificação foi realizada através de testes bioquímicos padrão em nosso laboratório de microbiologia clínica. Todos os isolados foram obtidos a partir da urina. Os padrões de fragmentos restritos de SpeI do DNA cromossômico destes cinco isolados variaram (Figura 1). As bactérias foram armazenadas a -70°C em caldo de infusão cardíaca (Nissui Pharmaceutical, Tóquio, Japão) contendo 20% de glicerol. Subsequentemente, as bactérias foram inoculadas em placas de ágar de infusão cardíaca (Nissui Pharmaceutical) e incubadas a 37ºC durante a noite. Os MICs eram determinados por um método de diluição do ágar como descrito pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), antigo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).14 Os testes de susceptibilidade eram realizados usando ágar Mueller-Hinton (Nippon Becton Dickinson, Tokyo, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Os critérios interpretativos MIC para ceftazidima, imipenem, meropenem, norfloxacina, levofloxacina, gatifloxacina, gentamicina, amikacina e minociclina seguiram os do CLSI/NCCLS.14 Não foram definidos os pontos de quebra MIC de outros agentes antimicrobianos.

Antimicrobianos

Amplificação e sequenciamento de DNA de regiões determinantes da resistência a quinolonas

O DNA cromossômico foi extraído de isolados de P. putida, como descrito anteriormente.15 A amplificação PCR foi realizada com conjuntos de primers específicos. Um conjunto de iniciadores de 5′-gacggcctgaagcccctgcac-3′ e 5′-gcccacggcgataccgctgga-3′ amplificou um fragmento de 417 bp das regiões determinantes da resistência a quinolonas (QRDRs) do gene gyrA das posições 115 a 531.16 Um conjunto de iniciadores de 5′-agtacttcgccgacttcct-3′ e 5′-tacaggcgcgacaggctgcgct-3′ amplificou um fragmento de 739 bp dos QRDRs do gene gyrB das posições 1073 a 1811.17 Um conjunto de iniciadores de 5′-tctacaggccatgagcgaactgg-3′ e 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ amplificou um fragmento de 262 bp dos QRDRs do gene parC das posições 158 a 419.18 Amplificações foram realizadas com a enzima Advantage-GC2 (BD Biosciences Clontech Japan, Tokyo, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Os QRDRs foram sequenciados usando um terminador BigDye v3.0 Taq cycle sequencing ready reaction kit com AmpliTaq DNA polimerase (Perkin-Elmer, Foster City, CA, EUA) e um sistema automatizado de sequenciamento de DNA (ABI PRISM 310 genetic analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

Detecção genética dos genes da metallo-β-lactamase

Preparação de proteínas de membrana externa

Proteínas de membrana externa (OMPs) foram preparadas como descrito anteriormente.21 As amostras foram analisadas pela SDS-PAGE.

Resultados

Susceptibilidade

Resultados de testes de susceptibilidade para fluoroquinolonas e carbapenêmicos estão resumidos nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Os MICs de β-lactams variaram de >128 mg/L para ampicilina e cefaloridina, 2 a >128 mg/L para ceftazidima, 1 a 128 mg/L para imipenem, 0,5 a >128 mg/L para panipenem, 4 a >128 mg/L para meropenem e 1 a >128 mg/L para biapenem. As gamas MIC de aminoglicosídeos e minociclina foram as seguintes: 0,25 a 8 mg/L para gentamicina, 0,5 a 8 mg/L para amikacina, 0,5 a 1 mg/L para a canamicina e 4 a 64 mg/L para a minociclina. Quatro isolados eram resistentes ou intermediários às fluoroquinolonas e aos carbapenêmicos, enquanto um isolado, HU2001-429, era suscetível tanto às lactams quanto às fluoroquinolonas β. Três isolados de P. putida, HU2001-412, HU2001-419 e HU2001-451, mostraram resistência a todos os lactams examinados, como ceftazidime, imipenem e meropenem. Três isolados, HU2001-412, HU2001-419 e HU2002-467, mostraram alta resistência à fluoroquinolona (>128 mg/L), incluindo norfloxacina, levofloxacina, esparfloxacina, gatifloxacina e pazufloxacina, e também resistência à minociclina (32 a 64 mg/L). Nos cinco isolados, a faixa de MIC para sitafloxacina estava entre ≤0.125 e 8 mg/L.

Resistência à fluoroquinolona

Resistência à carbapenem

De cinco isolados de P. putida, quatro mostrando resistência à carbapenem levaram o gene da metallo-β-lactamase do tipo IMP, enquanto os genes da metallo-β-lactamase do tipo VIM não foram detectados por PCR (Tabela 2). Os intervalos MIC de carbapenêmicos em P. putida portadores do gene da metallo-β-lactamase do tipo IMP foram os seguintes: 8 a 128 mg/L para imipenem, 32 a >128 mg/L para panipenem, 128 mg/L ou superior para meropenem e 32 a >128 mg/L para biapenem. Em P. putida HU2001-451, que apresentou os maiores MICs de carbapenêmicos entre os cinco isolados, a produção de 46 kDa OMP foi indetectável pela SDS-PAGE, enquanto os de P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 e HU2002-467 foram detectados de forma semelhante (Tabela 2).

Discussão

Neste estudo, caracterizamos susceptibilidades a fluoroquinolonas e carbapenêmicos em cinco isolados clínicos de P. putida isolados de diferentes pacientes com IU agudas, repetidas ou crônicas. Todos os cinco isolados apresentaram diferentes genótipos de PFGE, o que sugere que nenhuma das infecções causadas por estes P. putida era nosocomial. Quatro dos cinco isolados eram resistentes ou intermediários tanto às fluoroquinolonas como aos carbapenêmicos. Três isolados mostraram alta resistência (>128 mg/L) a todas as fluoroquinolonas examinadas, exceto a sitafloxacina. Dentre as fluoroquinolonas investigadas neste estudo, a sitafloxacina mostrou potência superior contra os isolados de P. putida. Estes isolados altamente resistentes às fluoroquinolonas também eram resistentes aos carbapenêmicos e à minociclina. Todos os isolados foram susceptíveis a aminoglicosídeos como amikacina.

Estudos de resistência à fluoroquinolona em P. putida são limitados.6,12 Em P. aeruginosa, os principais mecanismos responsáveis pela resistência à fluoroquinolona incluem mutações de aminoácidos na girose de DNA ou topoisomerase IV causadas por mutações nos QRDRs de GyrA e ParC, enquanto alguns relatos têm sugerido envolvimento de mutações de GyrB na resistência à fluoroquinolona.18,22 Um mecanismo secundário de resistência em P. aeruginosa que envolve sistemas efluxos contribui para a redução da susceptibilidade às fluoroquinolonas.22,23 Neste estudo, foram comparadas alterações de aminoácidos nos QRDRs de GyrA, GyrB e ParC entre cinco isolados clínicos de P. putida. A P. putida resistente à fluoroquinolona teve mutações adicionais como Thr-83→Ile no GyrA e Glu-469→Asp no GyrB, que corresponderam a mutações encontradas na P. aeruginosa resistente à fluoroquinolona.22,23 Esses resultados indicam que mutações de aminoácidos nos QRDRs como Thr-83→Ile em GyrA e Glu-469→Asp em GyrB podem contribuir para uma alta resistência às fluoroquinolonas, embora não tenha sido determinado se a transformação por plasmídeos portadores dos genes tipo gyrA, gyrB ou parC em tais isolados reduziria as MICs das fluoroquinolonas.24 A faixa de MIC da sitafloxacina estava entre ≤0.125 e 8 mg/L para os cinco isolados de P. putida. Embora relatórios anteriores tenham mostrado que a superexpressão dos sistemas de efluxo de TtgABC, MepABC, TtgDEF e ArpABC também pode contribuir para a resistência a múltiplas drogas em P. putida,10,11,12 o papel dos sistemas de efluxo permaneceu pouco claro neste estudo.

Foi relatada a resistência de Carbapenem em P. putida causada pela produção de metallo-β-lactamases.3,4,8,9,9a Estas metallo-β-lactamases encontradas em P. putida incluíam os tipos IMP e VIM.3,4,8,9,9a Nas quatro P. putida resistentes a carbapenem, a produção de metallo-β-lactamases foi detectada por um método de difusão em disco (dados não mostrados). Estes isolados transportaram os genes da metallo-β-lactamase do tipo IMP, enquanto os genes da metallo-β-lactamase do tipo VIM não foram detectados por PCR. A prevalência de P. putida produtora de metallo-β-lactamase é um problema clínico importante, representando um reservatório de determinantes genéticos da resistência à metallo-β-lactamase do tipo β. Na P. aeruginosa, outros mecanismos importantes de resistência ao carbapenêmico incluem a impermeabilidade mutacional decorrente da perda de OprD – um canal transmembrana formador de porosidade acessível a carbapenêmicos, mas não a outros β-lactamases – a partir da produção de metallo-β-lactamases.21,25,26 A perda de OprD resulta em resistência ao imipenem e redução da suscetibilidade ao meropenem em P. aeruginosa.27 Em P. putida HU2001-451, mostrando os maiores MICs (≥128 mg/L) de todos os carbapenems entre quatro isolados resistentes ao carbapenem, a produção de 46 kDa OMP foi reduzida em comparação com a de outros isolados. Os perfis OMP de P. putida HU2001-451 foram semelhantes aos de P. aeruginosa resistente ao carbapenem, nos quais a produção reduzida de OprD foi identificada em nosso estudo anterior.21 Estes resultados mostraram um efeito combinado da produção reduzida de 46 kDa OMP coexistindo com a produção de metallo-β-lactamases sobre a resistência ao carbapenem no isolado, embora não esteja claro se outras β-lactamases tinham relevância para a resistência ao carbapenem.

Em conclusão, caracterizamos a resistência à fluoroquinolona e ao carbapenem em isolados clínicos de P. putida. Nossos resultados indicam que mutações de aminoácidos nos QRDRs, tais como Thr-83→Ile em GyrA e Glu-469→Asp em GyrB, podem contribuir para alta resistência às fluoroquinolonas em P. putida. Quatro isolados de P. putida produtores de metallo-β-lactamas que mostraram resistência a carbapenêmicos transportaram o gene da metallo-β-lactamase tipo IMP. Encontramos um efeito combinado de produção reduzida de 46 kDa OMP e produção de metallo-β-lactamases que aumentavam a resistência ao carbapenem em um isolado de P. putida mostrando a maior MIC de carbapenems.

Agradecemos ao Miroku Medical Laboratory, Saku, Nagano, Japão, pela análise de PFGE. T. H. é apoiado por uma Grant-in-Aid for Scientific Research (17790353) do Ministério da Educação, Cultura, Esporte, Ciência e Tecnologia do Japão.

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