Thiols reagem com este composto, clivando a ligação de dissulfureto para dar 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB-), que ioniza o TNB2- dianion em água a pH neutro e alcalino. Este íon TNB2- tem uma cor amarela.
Esta reacção é rápida e estequiométrica, com a adição de uma molécula de tiol libertando uma molécula de TNB. O TNB2- é quantificado num espectrofotómetro medindo a absorvância da luz visível a 412 nm, usando um coeficiente de extinção de 14.150 M-1 cm-1 para soluções tampão diluídas, e um coeficiente de 13.700 M-1 cm-1 para concentrações elevadas de sal, como o cloridrato de guanidínio 6 M ou a ureia 8 M. Infelizmente o coeficiente de extinção para soluções diluídas foi subestimado na publicação original de 1959, como 13.600 M-1 cm-1, e como observado em um artigo recente, este erro persistiu na literatura. O DTNB comercial pode não ser completamente puro, portanto pode requerer recristalização para obter resultados completamente precisos e reprodutíveis.
Reagente de Elman pode ser usado para medir tióis de baixa massa molecular, como glutationa, tanto em soluções puras quanto em amostras biológicas, como o sangue. Também pode medir o número de grupos de tiol em proteínas.