Purificação do ADN de cadeia única por co-polimerização com acrilamida e electroforese

O ADN isolado (ssDNA) é útil para aptamers (1), self-assembly (2), DNA origami (3), circuitos de ADN (4), sondas de hibridação (5), e robótica de ADN (6). O DNA sintetizado quimicamente é de cadeia única por padrão.

Aqui, apresentamos um método para produzir ssDNA a partir de um produto PCR. O uso de um produto PCR em vez de ADN sintético pode ser vantajoso, uma vez que a PCR introduz menos mutações do que a síntese química e pode gerar DNAs mais longos do que o limite base ∼120 para a síntese química. A partir de uma amostra clonal, os produtos PCR também podem ter uma pureza de seqüência significativamente maior do que o DNA quimicamente sintetizado. A alta pureza de seqüência é crítica para um alto desempenho na tecnologia de circuitos de DNA (7).

Nosso método de geração de fio único (SSG) é escalável e requer apenas uma etapa de purificação. Isto remove o fio complementar indesejado e realiza a purificação com base no tamanho do primer residual e dos produtos PCR indesejados. O SSG por co-polimerização e eletroforese pode ser aplicado ao produto de protocolos PCR avançados, como o conjunto Gibson (8), para criar produtos longos, de cadeia única e de sequência arbitrária. Isto pode ser útil para origami de DNA e outras aplicações de auto-montagem.

SSG aproveita uma modificação de DNA comercialmente disponível conhecida como acrydite. Esta modificação adiciona um grupo de vinil polimerizável, que se incorpora a uma cadeia crescente de polímeros de acrilamida (9). O ADN modificado com acrilamida tem sido utilizado para várias aplicações, incluindo um hidrogel comutável (10), captura de mercúrio (11) ou PDGF (12), e para modificar a taxa de electroforese de sequências específicas (13). Nossa técnica é superficialmente semelhante ao método pelo qual o grupo Church imobilizou colônias de polimerase dentro de géis finos de poliacrilamida. A acrilita é crítica para a formação de produtos PCR clonais (polônias) em algumas formas de seqüenciamento de DNA (14).

Em casos em que quantidades significativas de ssDNA puro são necessárias, nossa abordagem usando primers modificados com acrilita e imobilização de poliacrilamida é uma opção que vale a pena. Mostramos também que esta técnica pode integrar SSG, separação de tamanho e eletroeluição em uma única etapa.

Materiais e métodos

Sem outras indicações, os reagentes foram adquiridos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO) e utilizados sem purificação adicional. O DNA foi adquirido da IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) e utilizado sem purificação adicional (para informações de seqüência, veja a Tabela Suplementar S1).

Demonstração da captura de acrilamida

Para a demonstração inicial do SSG por co-polimerização com acrilamida e depois eletroforese, modificamos um primer com acrilamida e corante vermelho fluorescente Cy5. O outro primer foi adquirido com uma fluorescência verde 5′ fluoresceína modificada. A figura 1 mostra como a amostra de DNA foi preparada misturando 100 μl gel desnaturante a 10% (pré-polímero antes do início da polimerização) com 100 μl produto PCR (∼20 pMol do produto) e a massa apropriada de uréia seca (concentração final de acrilamida a 5%, concentração final de uréia a 7 M). O DNA/prepolímero foi carregado em um poço seco de um gel PAGE desnaturante a 5%. O gel foi aquecido conforme descrito abaixo, e foi realizada eletroforese para separar o fio fluorescente verde do fio fluorescente vermelho imobilizado. O gel resultante foi imitado usando um sistema de imagem padrão de gel com iluminação LED (FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA).

Geração e purificação de fio único (eletroforese vertical do gel)

PCR foi realizado em todos os casos com o kit de reação Accuprime Pfx (Life Technologies, Grand Island, NY) usando modelo 50 nM, 10 μM de cada primer, e 8 ciclos térmicos. O produto PCR foi desnaturado pela adição de ureia sólida a uma concentração final de 7 M em uma reação de 100 μl. A poliacrilamida foi preparada a partir de uma solução de reserva obtida comercialmente de 40% de acrilamida em água com uma relação de 19:1 de acrilamida:bis-acrilamida (Bio-Rad, Hercules, CA). A poliacrilamida desnaturada foi preparada com concentrações finais de 7 M de ureia, 20% de acrilamida e 0,25× tampão TBE. A polimerização foi iniciada pela adição de 1 μl de TEMED (N,N,N′,N′-tetrametiletilenodiamina) e 10 μl persulfato de amónio 10% a uma alíquota de 1 mL de pré-polímero de acrilamida desnaturalizante. Uma porção desta mistura (pré-polímero antes do início da polimerização) foi rapidamente misturada 1:1 com 100 μl produto PCR (cinco reacções PCR 20-μl por instruções do fabricante, agrupadas) com 7 M de ureia (10% de acrilamida, concentração final). A mistura PCR/polimerização de acrilamida foi adicionada a um poço seco num gel PAGE desnaturante vertical padrão. A polimerização completa da PCR/denaturing acrylamide foi assegurada através da lavagem do espaço acima do poço com um fluxo suave de argônio ou 99,97% de nitrogênio (para deslocar qualquer oxigênio que inibe a polimerização). Após ∼30 min de polimerização, montamos o equipamento de eletroforese. Triturar a poliacrilamida e carregar as peças maceradas no poço produziu uma banda muito larga, de forma irregular, pelo que esta abordagem foi abandonada (dados não mostrados). A polimerização dentro do poço foi uma abordagem superior. Aquecemos o tampão de funcionamento no microondas até ferver e adicionámos o tampão quente (∼80°C-90°C) ao reservatório catódico (vertendo o tampão quente sobre os poços cheios) de modo a encorajar a libertação do ADN do poço. A adição do tampão quente foi continuada até que o equipamento de gel estivesse cheio até o volume necessário para a eletroforese. O gel contendo ADN estava em contacto directo com o tampão quente à medida que a tensão era aplicada. O tampão quente deve ser aplicado prontamente e não deve ser permitido o resfriamento. Em seguida, realizamos a eletroforese de acordo com o diagrama mostrado na Figura 1.

SB (5 mM de borato de sódio) e os buffers TBE podem ser utilizados como buffers em execução. SB e TBE foram preparados em RT a pH 8,42 e 8,36 respectivamente. A 80°C, estes valores de pH mudam para 8,21 e 7,47, respectivamente. Esta mudança de pH é transitória. O gel esfria até 30°C-40°C durante a eletroforese. Esta mudança no pH não causou degradação notável do DNA.

A fim de visualizar a separação dos dois fios, nós usamos primers modificados com dois fluoróforos diferentes. O cordão móvel foi gerado usando um primer modificado com fluoresceína. O primer (acrydite) para o cordão imóvel foi preparado com uma modificação interna do Cy5. Usando estes dois corantes, foi possível visualizar o progresso da separação. Digitalizámos este gel com um gerador de imagens de gel (FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA) após 45 min de electroforese a 500 V.

Como abordagem alternativa, o produto PCR pode ser pré-concentrado por precipitação padrão de etanol. O pellet pode então ser dissolvido em um volume menor de pré-polímero de acrilamida. Em nossas mãos, o aumento da concentração no poço foi compensado por perdas durante a precipitação. Em alguns casos (por exemplo, para uma banda de produto fraco) esta abordagem pode ser preferida.

A banda fluorescente com o produto modificado por fluoresceína de fio simples foi cortada do gel sob iluminação LED azul a ∼475 nm (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). O DNA foi eluido pelo método padrão de esmagamento e impregnação (15). Quando o DNA eluído (recuperado) estava muito diluído para uma precipitação eficiente de etanol, nós o concentramos por extração com butanol. O produto foi então precipitado com etanol e analisado como indicado abaixo.

Análise de PAGE

Os produtos marcados com fluoresceína (ssDNA liberado por desnaturalização PAGE) foram analisados quanto à pureza usando PAGE nativa. Ressuspensámos o produto em 10 μl e quantificámo-lo através da espectroscopia UV-Vis. Fizemos concentrações molares iguais de primer e produto de corda única e eletroforamos essas amostras e uma escada fluorescente verde 25-bp (Jena Bioscience, Jena, Alemanha) em um gel PAGE nativo de 15%, que foi visualizado com o Storm scanner para o sinal fluorescente.

Análise de têmpera

Para estabelecer ainda mais que o produto era, de facto, de fio único, testamos a hibridação de um oligonucleótido complementar (quench probe) contendo uma modificação de têmpera 3′. Quando devidamente hibridizada, a sonda de têmpera posiciona um supressor Iowa Black dentro de alguns nanómetros da modificação de 5′ fluorescein no cordão complementar. Isto provoca uma diminuição acentuada da intensidade de fluorescência. A sonda de têmpera só se hibridizará para ssDNA. Se o produto for de fio duplo, então a hibridação será bloqueada e a fluorescência não será afetada. Triplicar 10 μl amostras de 100 nM de produtos modificados por fluoresceína (produto PCR, produto SSG, e controlo de primer) foram preparadas em tubos PCR. Estas foram medidas com um fluorómetro QuantiFluor (Promega, Madison, WI) para os valores iniciais de fluorescência, e foram adicionados 1,1 molares equivalentes de ADN de sonda de têmpera, vortexados, centrifugados, e deixados incubar durante aproximadamente 1 min. A fluorescência foi então registada para determinar se ocorreu qualquer têmpera.

Comparação de técnicas de geração de uma única cadeia para produção de aptamer

A fim de determinar a eficácia deste método para gerar aptamers funcionais, adquirimos um modelo para amplificação PCR de uma sequência conhecida de lisozima de ligação de aptamer. Amplificamos este modelo com um primer modificado por fluoresceína e um primer reverso modificado por acrydite. Realizamos o protocolo SSG como descrito acima. Nós conjugamos lisozima com 5.8 μm carboxilate-modified beads (Bangs Labs, Fishers, IN) pelo protocolo de acoplamento padrão EDC. Estes grânulos foram incubados com o produto SSG, DNA fluorescente randomizado (sem semelhança com o aptamer), e um aptamer fluorescente quimicamente sintetizado da mesma sequência. Também incubamos contas não revestidas com o aptamer fluorescente quimicamente sintetizado como um controle negativo. As incubações foram realizadas durante 30 minutos e os grânulos foram lavados 3 vezes. A citometria de fluxo foi realizada nestas partículas com um FACScalibur (BD Bioscience San Jose, CA). A distribuição das intensidades de fluorescência com excitação por luz de 488 nm foi registrada.

Geração e purificação de cordão único (eletroforese horizontal em gel)

A gel de poliacrilamida desnaturante de 7 M de uréia foi fundido horizontalmente como descrito anteriormente (16). Em resumo, 25 mL de solução de pré-polímero (7M uréia, 6% acrilamida/bis-acrilamida, tampão SB) foi iniciada com 84 μl APS e 20 μl TEMED. O pré-polímero em gel foi vertido em um molde horizontal. O molde foi então colocado em um saco plástico, que foi purgado com nitrogênio. O gel foi polimerizado por 30 minutos. Os DNAs marcados com fluoresceína e acrydite foram misturados em fosfato de sódio 1 M a pH 8,0 e recozidos, elevando a temperatura para 80°C e esfriando lentamente a 0,1°C por segundo para RT. A mistura foi resfriada lentamente para promover a hibridação intermolecular entre dois filamentos. A mistura pré-polímero (2,5 mL) foi iniciada adicionando 8,4 μl APS e 2 μl TEMED. Uma vez misturados, 20 μl desta solução foram adicionados à solução de ADN 5 μl. Isto foi então transferido para um poço seco no gel de poliacrilamida. A fim de evitar distorções nas linhas do campo elétrico, os poços restantes foram preenchidos com acrilamida não contendo ADN. O gel carregado foi colocado em um saco plástico e purgado com nitrogênio. O gel foi rodado a 10 V/cm durante 10 minutos. Em seguida, foi imergido com um transiluminador LED azul e uma câmera digital. Para liberar o ssDNA do gel reticulado no poço, um tampão SB de 25 mL foi aquecido até ferver em um microondas. Este tampão quente foi então derramado sobre o gel. A electroforese foi continuada a 10 V/cm durante 10 minutos. O gel foi novamente imitado como descrito acima para comparação.

Associação inicial entre a fluoresceína e o DNA marcado com acrilato foi promovida usando tampão de fosfato de sódio 1 M. Se o DNA fosse mantido junto apenas por hibridação, a uréia 7 M e a troca do tampão em tampão SB de 5 mM durante a eletroforese seria adequada para liberar o DNA no gel. Ao invés disso, era necessário calor. Isto demonstrou que a fita de DNA móvel está associada ou enredada com o gel e não com sua fita de DNA complementar.

Resultados e discussão

Acrydite-modified DNA is immobile under electrophoresis

Das duas fitas do produto dsDNA PCR, a fita de acrydite está presa no copolímero, enquanto a fita complementar é móvel. Para demonstrar isto, a PCR foi realizada com um primer modificado com acrilita e um corante vermelho fluorescente (Cy5). O primer invertido foi modificado com fluoresceína. O produto PCR foi polimerizado em um gel PAGE desnaturalizador (5%). Um diagrama esquemático do processo é apresentado na Figura 1. Inicialmente, ambos os fios fluorescentes verde e vermelho são co-localizados (gel de cor amarela). Após a aplicação da tensão, apenas o produto marcado com fluoresceína (verde) migra para o gel. Os fios marcados com acrydite e Cy5 (vermelho) são fixados na imagem final do gel (Figura 1B). Adicionalmente, o primer residual da reacção PCR é claramente visível como uma segunda banda verde. Após electroforese, o produto puro, de corda única pode ser cortado e eluido por protocolos de purificação de gel padrão.

Verificação de ADN de corda única

Isolamos ADN de corda única, modificada por fluoresceína, cortando e eluindo a banda de interesse. Para mostrar que o produto recuperado por este método é de corda única, utilizamos dois métodos diferentes. O primeiro método foi a análise em gel nativo. A figura 2A mostra uma imagem de um gel nativo contendo o primer, produto PCR (dsDNA) e ssDNA purificado por este método. O gel nativo mostra uma clara separação entre o dsDNA e o ssDNA. Depois do SSG com o primer acrydite (seguido do corte do gel e da eluição do produto) a maior parte do ADN isolado é de cadeia única.

Corroborámos este resultado utilizando uma sonda de hibridação modificada por têmpera (Figura 2B). A sonda foi projetada para trazer um supressor para a proximidade da fluoresceína do produto ssDNA. Após a hibridização, a molécula de têmpera reduz a intensidade de fluorescência em 8% em ∼90. Como a sonda só se hibrida ao ssDNA, esta experiência demonstra que o produto modificado com fluoresceína era de uma só corda. Como controle negativo, também testamos o produto dsDNA PCR. O produto PCR de dupla corda foi incapaz de hibridizar para a sonda quencher; portanto, sua fluorescência permaneceu praticamente inalterada.

Aptâmeros sintetizados por PCR purificados por co-polimerização e eletroforese

SsDNA altamente puro é produzido pela nossa técnica SSG. Purificamos os produtos aptamer de ssDNA a partir de PCR usando dois métodos: (i) SSG por co-polimerização e eletroforese e (ii) uma técnica de imobilização biotina-avidina descrita em outra parte (i.e., Folha de Dados Técnicos 753 de Poliesciências) (17,18). Os aptamers de uma só corda também foram gerados por síntese química. A Figura 3A mostra os aptamers ssDNA gerados usando os três métodos diferentes. A pista 1 é uma escada de marcação para comparação de tamanhos. A pista 2 mostra o ssDNA purificado gerado por PCR com um primer de acrilamida seguido por co-polimerização com acrilamida, eletroforese e purificação em gel. Apenas uma faixa é visível no tamanho correto para o ssDNA. A faixa 3 é o ssDNA gerado por PCR com um primer biotinilado seguido de purificação com contas magnéticas revestidas com avidina. A pista 4 é o DNA quimicamente sintetizado com a mesma sequência. O aptamer de ssDNA purificado do SSG por co-polimerização e eletroforese mostrou alta pureza de ssDNA.

A seguir procuramos testar se este procedimento produzia aptamers funcionais. Para isso, geramos um aptamer previamente descrito contra lisozima usando PCR com iniciadores modificados. O aptamer anti- lisozima “Clone 1” foi produzido pela primeira vez no laboratório Ellington e foi originalmente selecionado como um aptamer RNA (19); outros grupos relataram que a seqüência de DNA também atua como um aptamer (20,21). Verificamos que tanto a PCR quanto a síntese química de DNA produziram um aptamer funcional. Com base nestes e outros experimentos, concluímos que este é um dos poucos casos excepcionais em que o RNA e sua seqüência de DNA pai ligam ambos o alvo. Este é um resultado estranho e coincidente; a maioria dos aptamers não funcionam quando traduzidos diretamente para uma química diferente. Estes resultados corroboram os muitos exemplos na literatura que indicam que o aptamer Clone 1 anti-lisozima é um caso especial.

Análise de citometria de fluxo também mostrou que o aptamer ssDNA purificado por SSG é funcional. A Figura 4B mostra contas revestidas de lisozima expostas a DNA aleatório, o aptamer quimicamente sintetizado contra lisozima, ou nosso aptamer purificado pelo SSG contra lisozima. Tanto o aptamer purificado pelo SSG quanto o quimicamente sintetizado mostraram forte ligação com as contas revestidas de lisozima, enquanto o DNA aleatório não mostrou ligação significativa com as contas de lisozima. Isto indica que estas interações são específicas para a sequência do aptamer. Contas não revestidas não mostram fluorescência com ou sem o aptamer, indicando que a ligação é específica para a proteína.

Aquecimento liberta ADN dos poços

Ao purificar os aptamers de ssDNA do produto PCR utilizando o método SSG, foi necessário aquecer o gel para facilitar a electroforese do ADN (ver “Materiais e métodos”). Para entender por que isto era necessário, usamos o PAGE horizontal. Sem a aplicação de calor, o produto ssDNA PCR desejado foi retido no poço, apesar do uso de 7 M de ureia e do gradiente de voltagem.

A nossa primeira hipótese era que esta retenção se devia aos 80 bp de hibridação no produto PCR. Para testar esta teoria, reduzimos a complementaridade para 23 bp através do recozimento do DNA aptamer Clone 1 marcado com fluoresceína (denotado F-Aptamer na Figura 4) para um primer modificado com 23-nucleotídeos (denotado AC-Clone1-P2 na Figura 4) e realizamos SSG por co-polimerização e eletroforese. Apesar da hibridação relativamente curta de 23 bp, quantidades significativas do DNA do aptamer foram retidas no poço (Figura 4A, faixa inferior). Isso indicou que nossa hipótese estava incorreta, pois o menor trecho de hibridização de 23 bp, que deveria ser facilmente desnaturado em uréia de 7 M, não permitiu a liberação do fio de ssDNA desejado do poço.

Em seguida, testamos a hipótese de que a retenção dependia do comprimento. Aqui, recozemos um oligonucleotídeo de 19-nucleotídeos modificados (denoted AC-DNA in Figura 4) para um oligonucleotídeo de 19-nucleotídeos totalmente complementar, marcado com fluoresceína (denoted F-DNA* in Figura 4). Apesar do comprimento similar de hibridação, o DNA curto foi facilmente purificado de seu complemento em um gel desnaturante sem a aplicação de calor. Praticamente todos os 19-nucleótidos, marcados com fluoresceína, entram no gel (Figura 4A, faixa do meio). A fim de mostrar que o 19-nucleotídeo modificado com acrydite foi retido, um cordão modificado com fluoresceína e acrydite (denotado AC-DNA-F na Figura 4) também foi co-polimerizado no poço (pista superior) e foi retido com sucesso. (ver “Materiais e métodos” e Tabela Complementar S1 para detalhes de seqüência e nomenclatura)

Após os primeiros 20 min de eletroforese (sem aquecimento), ficou claro que grande parte do DNA do aptamer Clone 1 não era móvel (apesar de um curto comprimento de hibridação). Para liberar o DNA do aptamer da poliacrilamida, foi necessário aquecer o gel. Aquecíamos o tampão de funcionamento até quase ferver no microondas e depois despejávamo-lo sobre o gel na região dos poços. A eletroforese foi então continuada por mais 20 minutos (Figura 4B, faixa inferior), e a faixa do aptamer tornou-se então móvel. Esta nova banda tinha a mesma mobilidade que a banda móvel inicial, indicando que esta era a mesma espécie de aptamer. Da mesma forma, esta foi a mesma amostra de DNA que produziu apenas uma única banda na Figura 3A. Esta experiência demonstra a necessidade de aquecer o gel para liberar todo o ssDNA longo da poliacrilamida. A retenção de DNA no poço não se deve à hibridização, mas provavelmente se enredará na matriz de poliacrilamida.

PÁGINAORIZONAL para geração de fio único e eletroelução integrada

O uso de um gel horizontal permite que a eletroelução seja realizada em vez de cortar e extrair a banda do produto. A utilização de um segundo pente de extracção para poços adicionais para electroelução e extracção em PAGE horizontal tornou o SSG e a electroelução do ADN mais rápidos. Utilizámos o software Inkscape para conceber um pente separado para electroelução que fosse mais profundo e largo do que o pente de carga (ver Material Suplementar para o modelo utilizado para cortar os pentes). O desenho foi cortado a laser em acrílico com um cortador a laser de CO2 (ver Figura 5, A e B).

Tipicamente, o PAGE é realizado usando um gel vertical entre placas de vidro. Para lançar um gel PAGE horizontal, foi necessário excluir o oxigênio durante a polimerização. Realizamos a polimerização em uma bolsa cheia de gás nitrogênio (ou argônio) para excluir o oxigênio. O gel foi fundido com os dois pentes, e a eletroforese foi realizada por eletroforese em gel horizontal padrão.

Figure 5C mostra um gel horizontal para SSG por co-polimerização e eletroforese com eletroeluição. As pistas 1-4 (de cima) contêm uma piscina aptamer. A pista 5 foi deixada vazia para evitar qualquer contaminação cruzada inadvertida; o padrão primário da pista 6 estava presente para distinguir a banda indesejada. A piscina foi amplificada usando um primer modificado com acrydite e um primer marcado com fluoresceína. O cordão modificado com acrilita foi retido no poço. O produto rotulado com fluoresceína é claramente visível sob a iluminação LED azul. Permitimos que o primário passasse pelos poços de extracção e saísse pelo outro lado do gel (ver figura 5D). As faixas do produto puderam então ser observadas aproximando-se dos poços de extracção sob um transiluminador de luz azul em tempo real. Quando as faixas de produto entraram nos poços, elas foram aspiradas com uma pipeta. O processo levou aproximadamente 1 h. A precipitação e a recuperação prosseguiram de acordo com os protocolos de selecção do aptamer publicados. Isto eliminou a necessidade de uma etapa separada de separação de fios ou uma extracção nocturna do gel.

Existem vários métodos para isolar o ssDNA do dsDNA. Os métodos para purificar o ssDNA a partir de produtos PCR incluem: deslocamento de mobilidade induzido (22), imobilização de esferas de biotina (18), digestão selectiva com um DNase (23), e adição assimétrica de iniciadores de PCR (24). Estes métodos variam em custo, pureza e escalabilidade. Uma mudança de mobilidade induzida (22) em um primer pode causar problemas na amplificação (por exemplo, os primers modificados por PEG podem funcionar menos bem em PCR), e a digestão enzimática com um DNase (23) ou a quebra química de um filamento deixará impurezas (assim como a introdução de outra etapa no processo geral). A adição assimétrica de iniciadores de PCR (24) deixará uma quantidade significativa de dsDNA no produto e é altamente propensa a erros de amplificação. O método mais popular é extrair o fio indesejado e biotinizado usando microesferas revestidas com avidina (18). Este método tem várias armadilhas. O primer não reagido ocupa os locais de avidina nas esferas, e a interação biotina-avidina se quebrará à temperatura de fusão do DNA longo e de dupla cadeia (25). Isto contribui para impurezas significativas de dsDNA. Os métodos baseados em esferas têm custos significativos: $1,80/nMol para contas de avidina mais $0,50/nMol para o primer de biotina. O SSG por co-polimerização e eletroforese requer apenas o primer acrydite, que custa $0,80 por nMol. A poliacrilamida é muito barata e escalável. A mobilidade eletroforética é uma segunda dimensão da purificação inerente à técnica. Tanto o cordão modificado com acrilita como qualquer primer residual são removidos da reacção PCR num único passo.

Mostrámos que o SSG pode ser usado para purificar um aptamer funcional. A técnica também pode ser usada para purificar uma piscina de ssDNA no decurso da selecção do aptamer de ADN. Além disso, o SSG também pode encontrar aplicação para gerar ssDNA para sondas de afinidade ou backbones para origami de DNA (3). É importante notar que, comparado com a síntese química, a produção de DNA por PCR tem uma fidelidade de seqüência muito maior, o que é crucial para aplicações como computação de DNA/ circuito de DNA (26).