Respostas celulares e moleculares ao tratamento da cocaína aguda em células N2a do tipo neuronal: mecanismo potencial para sua resistência na morte celular

Materiais

Cultura celular

As células N2a (CCL-131, ATCC) foram mantidas como cultura monocamada48, e tem sido amplamente empregada para estudos sobre substâncias de abuso14,49,50 ou distúrbios do SNC como Parkinson51 ou doenças de Alzheimer47,52,53. Uma vantagem desta linha celular é que as finas alterações morfológicas devidas a qualquer exposição química podem ser facilmente detectadas devido ao seu maior tamanho celular. A menos que especificado em contrário, todas as experiências do nosso estudo foram realizadas em meio RPMI-1640 sem fenol, contendo 10% de FBS. Foi permitido o crescimento de células pós-semente em placas ou pratos de cultura durante 4-5 dias na incubadora, para diferenciação espontânea dos crescimentos neurite. Todos os estudos foram repetidos pelo menos duas vezes.

Morfologia

Para avaliações morfológicas das células brutas, as células coradas de violeta cristal37 foram fotomicrografadas usando EVOS Cell Imaging Systems com objetiva ×40. Em alguns estudos, a morfologia ou vacúolos de células com coloração violeta cristalina foram tomados usando um microscópio Olympus IX-70 com contraste de fase invertida. Os novos crescimentos foram quantificados usando o software image J (National Institutes of Health).

Electrofisiologia

A braçadeira de células de todo o tipo foi usada para gravar a partir de células N2a cultivadas em lâminas de cobertura plástica. As lâminas de cobertura foram lavadas três vezes com solução de registro extracelular contendo (em mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glicose e 10 HEPES (312 mOsm, pH 7,4) e foram incubadas nesta solução à temperatura ambiente. As lâminas de cobertura foram deixadas sem tratamento ou tratadas com 6,25 μM ou 4 mM de cocaína diretamente na solução extracelular durante o registro. Os eletrodos de vidro (resistência 1-5 MΩ) foram preenchidos com solução intracelular contendo (em mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES e 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4). As células foram visualizadas sob contraste de fase com um microscópio Nikon Eclipse Ti-U invertido e câmera digital monocromática DS-Qi1 acoplada.

As gravações foram feitas com um amplificador Axopatch 200B (Dispositivos Moleculares, CA) e digitalizadas com um sistema Digidata 1440A (Dispositivos Moleculares, CA). As correntes iônicas foram registradas sob um protocolo de grampo de tensão (-60 a 135 mV em passos de 15 mV, 250 ms de duração). Correntes espontâneas pós-sinápticas foram registradas sob uma braçadeira de tensão contínua a -80 mV durante 2 min. Um protocolo de pinça de corrente (-100 a 200 pA em passos de 20 pA, 800 ms de duração) foi utilizado para avaliar a capacidade das células N2a de disparar potenciais de acção em resposta à injecção de corrente. Os sinais foram filtrados a 1 kHz e amostrados a 10 kHz. Os dados foram coletados e analisados usando o software pCLAMP 10 (Molecular Devices, CA).

Tratamentos

Uma quantidade conhecida de cloridrato de cocaína foi dissolvida em solução salina tampão fosfato (PBS) como estoque de 1 M imediatamente antes dos ensaios. A fim de simular concentrações farmacológicas in vivo de cocaína, variando de 1 nM a 6,25 μM, vários estoques de trabalho (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200, e 400 μM) foram preparados em PBS; similarmente, para concentrações mais altas de cocaína (2, 3, e 4 mM final), foram preparados estoques de trabalho de 80, 120, e160 mM em PBS. De cada estoque de trabalho, 5 μl cocaína foi adicionada por poço para alcançar as concentrações desejadas, assim como para prevenir alterações de pH no meio de cultura37. O volume final em cada poço foi de 200 μl. Enquanto a seleção das concentrações mais baixas foi baseada nos relatos de nano a cocaína micro molar mais baixa nas células do SNC de viciados13, as concentrações mais altas foram baseadas em vários estudos in vitro14,15,16. Células com volume médio isolado ou igual de veículo (PBS) em meio serviram como controles, enquanto o meio sem células foi tomado como um branco. Com base em nossos estudos anteriores em células do tipo astroglia C66, os tratamentos com cocaína no presente estudo também foram realizados por 1 h para fins de comparação. A propósito, o efeito da cocaína nos viciados desaparece dentro deste período para quantidades e rotas típicas de consumo33. Em um subconjunto de experimentos, as células em placas de 96 poços foram pré-tratadas com 1 µM YM155, um inibidor do gene sobrevivente, durante 30 min, seguido pelo co-tratamento da cocaína (2-4 mM) durante 1 h e avaliado para viabilidade celular, enquanto em outros estudos, as células foram pré-tratadas com 5 μM PIK-75, um inibidor do Nrf-224, durante 30 min antes do co-tratamento da cocaína (2-4 mM) durante 1 h e avaliado para viabilidade celular e níveis de GSH.

Viabilidade e vacuolação

A viabilidade celular foi avaliada pela captação de corante violeta cristal, conforme descrito anteriormente54,55. A extensão da vacuolação em células foi quantificada em células fixas de glutaraldeído pela captação de corante vermelho neutro, conforme descrito anteriormente56. O corante foi extraído com 70% de etanol e 0,37% de ácido clorídrico, e a absorvância a 540 nm foi tomada em um leitor de placas. As células coradas de violeta cristal foram usadas para fotomicrografia de vacúolos usando um microscópio Olympus IX-70 de contraste de fase invertida com uma objetiva ×40.

Video microscópio

Para videografia ao vivo, uma das lentes oculares do microscópio Olympus IX-70 de contraste de fase invertida foi substituída por um sistema de câmara de vídeo ocular padrão. A saída do conector do vídeo foi ligada a um computador para visualização da imagem no monitor utilizando o programa de software Electronic Ocular -R-AMCap, fornecido por Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, China). A documentação em vídeo foi obtida a uma velocidade de 14 quadros por segundo.

ensaio de integridade da membrana celular

A integridade da membrana celular foi determinada pela medição da liberação do LDH citoplasmático com o kit de ensaio CytoTox 96 não radioativo (Promega, Madison, WI), conforme as instruções fornecidas pelo fabricante. Em resumo, as células em placas de microtitulação de 96 poços foram tratadas com várias concentrações de cocaína (2, 3 e 4 mM) durante 1 h. Em seguida, 50 μl do meio de ensaio foram transferidos para uma nova placa de 96 poços, misturados com igual volume de mistura de substrato do kit, e incubados durante 30 min a 37 °C. A absorção foi feita em um leitor de placas a 490 nm.

Medição de ROS intracelular

Células em placas de 96 poços foram tratadas com cocaína a 2, 3 e 4 mM durante 1 h, seguida de coloração com um corante permeável a células H2DCFDA (10 μM final) por 30 min6. Após lavagem suave e secagem ao ar das células, foi adicionado PBS (100 μl/poço). As placas foram lidas com o filtro de excitação ajustado a 485 nm e o filtro de emissão a 530 nm num leitor automático (BioTek™ Synergy HTX multimode microplacas leitor, BioTek Instruments, Winooski, VT).

ensaio de peroxidação lipídica

Células foram semeadas a uma densidade inicial de 0,3 × 106 células por poço em placas de seis poços. A peroxidação lipídica foi medida conforme descrito anteriormente57. Em resumo, após tratamento com cocaína a 2, 3 e 4 mM durante 1 h, as células foram colhidas e centrifugadas a 13.000 rpm em uma microcentrífuga de mesa durante 6 min. Todas as pastilhas de células foram filtradas em PBS sobre gelo durante 3 s e transferidas para tubos de vidro. Em seguida, os lisados foram misturados com 30% de ácido tricloroacético, 0,37% de ácido tiobarbitúrico (TBA). A mistura foi fervida durante 10 min, resfriada à temperatura ambiente (RT), transferida para novos tubos falcão e centrifugada a 3038 × g durante 10 min. O sobrenadante transparente foi transferido para uma placa de 96 poços e a absorvância a 535 nm foi medida em um leitor de microplaca. O meio claro sem células foi usado como um branco.

Atividade metabólica mitocondrial geral e potencial de membrana

Células (2 × 104) foram tratadas com várias concentrações de cocaína (2, 3, e 4 mM) durante 1 h em placas de microtitulação de 96 poços. Então as placas foram centrifugadas a 304 × g durante 4 min, e a cocaína contendo meio foi descartada cuidadosamente. Após adicionar o meio fresco às células (200 μl) imediatamente, 10 μl de MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5(3-carboximetilfenol)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium, Promega) foi adicionado por poço como relatado anteriormente58 e incubado por 30 min a 37 °C. A absorção foi feita em um leitor de microplaca a 490 nm. O potencial de membrana foi testado de acordo com o procedimento anterior46. Ao final de 1 h de tratamento com cocaína, as células da monocamada foram sobrepostas com 100 μl de glutaraldeído aquoso a 0,25% para fixação, contendo Rh 123 para produzir uma concentração final de 2,6 μM durante 30 min a RT. O sobrenadante foi descartado, e as placas foram lavadas com água e ar seco no capuz. Finalmente, 100 μl de 0,1% de Triton×100 em PBS foi adicionado por poço e incubado a 37 °C durante 1 h. As placas foram lidas com o filtro de excitação ajustado a 485 nm e o filtro de emissão a 538 nm em um leitor de microplacas BioTek™ Synergy™ HTX multi-modo.

Detecção de lactato

Estudos realizados em células cultivadas em meio contendo 10% de FBS deram altos valores de fundo devido à interação sérica com alguns dos componentes do kit (Trinity Biotech, Jamestown, NY). Assim, em nossos estudos posteriores, antes dos tratamentos, 10% de FBS contendo meio foi substituído por soro reduzido (0,1% de FBS) em placas de microtitulação de 96 poços (2 × 104 células por poço). O reagente do kit foi dissolvido em solução cromogênica que consistia de ácido vanílico 5,3 mM, antipirina 4-amino 2,9 mM e cerca de 4 unidades de peroxidase de rábano silvestre. Ao final de 1 h de tratamento com cocaína, o reagente do kit foi adicionado diretamente aos poços (20 μl por 200 μl) e as placas foram mantidas na incubadora a 37 °C para o desenvolvimento da cor (5-10 min). A absorção das células não tratadas foi tomada como controle, enquanto o meio sem células foi tomado como um branco. A absorvância foi medida a 490 nm em um leitor de microplacas.

NMR espectroscopia

Lactate release from the cells was detected by proton (1H+) NMR spectroscopy. Como a quantidade de soro não interfere neste método, utilizamos 10% de FBS em meio em placas de microtitulação de 96 poços (2 × 104 células/200 μl por poço). Ao final de 1 h de tratamento com cocaína, o meio (0,15 ml por poço) de todas as réplicas (n = 12) de cada tratamento foi agrupado (1,8 ml) nos tubos rotulados. O meio das células não tratadas foi usado como controle. Como as amostras tratadas continham 2-4 mM de cocaína, adicionamos cocaína (4 mM final) ao meio em branco. As análises NMR foram realizadas na Bruker Avance 800 (\nu _0) = 800,23 MHz) que está equipada com um crioprobe TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z (a resistência máxima do gradiente de campo z é de 48 G/cm). Para a obtenção do espectro NMR unidimensional (1D), foram adquiridos 16 transientes e co-adicionados com 3 s de atraso de aquisição. Pontos de dados (32.000) foram empregados para a obtenção de uma largura espectral de 7500 Hz. O pico de água dominante posicionado a 4,75 ppm no espectro foi eliminado usando a seqüência de pulsos WATERGATE W520. Uma largura de banda de 3000 Hz ao longo de cada lado do pico de água foi dada como uma janela espectral para observar picos de soluto, empregando um tempo de atraso de 333,3 μs para os trens de pulso WATERGATE. Um padrão externo, solução aquosa de DMSO 3,3 mM, foi preparado para a quantificação do lactato na solução da amostra.

Medição de H2S em meio de cultura celular

Células foram semeadas a uma densidade inicial de 2 × 104 por poço em placas de 96 poços. Antes do tratamento com cocaína, 1,64% de acetato de zinco aquoso59,60 (final: 0,041%) foi adicionado às células para converter o gás volátil H2S em sulfeto de zinco durante o tratamento com cocaína. Após 1 h de tratamento com 2, 3, e 4 mM de cocaína, 17,453 mM N,N-dimetil-p-fenilenodiamina sulfato em 7,2 M HCl (final: 2,55 mM) e 26,18 mM FeCl3 em 1,2 M HCl (final: 3,83 mM) foram adicionados aos poços e vortexados suavemente. As bolhas no meio foram removidas pela adição de 5 μl de etanol frio em todos os poços pouco antes da leitura das placas a 670 nm em um leitor de microplacas.

ensaio de bioluminescência do ATP

Células em placas de microtitulação de 96 poços foram tratadas com várias concentrações de cocaína (2, 3 e 4 mM) durante 1 h. O ATP total foi medido usando o kit de ensaio Bioluminescente ATP Somatic cell assay (FLASC, Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do kit fornecidas pelo fabricante. Em resumo, ao final do tratamento, 75 μl de solução de libertação de ATP de células somáticas foi adicionado por poço para lisar as células. Então, 50 μl lisado foi transferido para novas placas brancas e transparentes de 96 poços, que já continham 50 μl de enzima de mistura de ensaio ATP sob luz reduzida. A luminescência foi medida imediatamente em um BioTek™ Synergy™ HTX multi-mode microplaca leitor.

Isolamento de RNA e síntese de cDNA

As células foram semeadas a uma densidade de 2 × 106 em pratos de cultura de 100 mm de diâmetro. No momento do tratamento, as células atingiram cerca de 65-70% de confluência. Após 1 h de tratamento com cocaína 2-4 mM, as células foram colhidas por meio de raspagem e centrifugadas a 1125 × g durante 5 min. O RNA total foi isolado conforme o protocolo fornecido pelo fabricante (Qiagen Sciences, cidade alemã, MD) usando mini colunas de spin RNeasy. O tratamento DNase I (Qiagen Sciences) foi realizado na coluna. O RNA total da coluna foi eluído com 20 μl de água livre de RNase. Para fins de quantificação, o RNA sobre gelo foi diluído em água livre de RNase na proporção de 1:10. A quantidade de RNA total foi medida pelo espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). O RNA mostrou uma razão de >1,95 a 260/280 nm, e foi posteriormente utilizado para a síntese de cDNA. Um micrograma de RNA total foi usado para produzir cDNA usando um kit de síntese iScript cDNA (Bio-Rad, Hercules, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Expressão relativa por RT-PCR quantitativa

Análise de expressão do gene Nrf-2, survivin (Birc5), e GAPDH por qPCR foi realizado em um termociclador iCycler com sistema de detecção MyiQ (Bio-Rad) usando iQ SYBR Green supermix. Os produtos Nrf-2, survivin e GAPDH foram sintetizados por reações PCR separadas, realizadas em 20 μl volume final com 2 μl de amostra de cDNA e 500 nM de primers específicos. As condições cíclicas foram as seguintes: 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s e 72 °C durante 30 s, enquanto a análise da curva de fusão após PCR foi realizada a 55-95 °C. A quantificação relativa das expressões gênicas foi realizada de acordo com o método 2-△△ com GAPDH como controle endógeno. As seqüências de primer utilizadas para análise estão apresentadas na Tabela 1.

Total GSH assay

Após tratamento com diferentes concentrações de cocaína (2-4 mM) em meio completo durante 1 h em placas de microtitulação de 96 poços, as células foram fixadas com glutaraldeído a 0,25% durante 30 min, seguido de lavagem suave três vezes, e secagem ao ar. O GSH celular total foi ensaiado como descrito anteriormente62. A absorvância foi medida a 412 nm em um leitor de microplacas.

Preparação de lisados de células inteiras

Para os ensaios enzimáticos, as células foram semeadas a uma densidade de 2 × 106 em pratos de cultura de 100 mm de diâmetro. Após 1 h de tratamento com 2-4 mM de cocaína, as células foram colhidas usando raspadores de células. Após centrifugação a 1620 × g durante 5 min, os granulados celulares foram armazenados a -70 °C até a sua posterior utilização. No dia dos ensaios, as pastilhas foram ressuspendidas em 0,5 ml de PBS e sonicadas duas vezes em gelo durante 15 s. O conteúdo foi transferido para tubos eppendorf e microcentrifugado a 5000 rpm durante 5 min. Os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos e utilizados para ensaios enzimáticos. A concentração de proteínas em cada lisado foi determinada utilizando o kit de ensaio de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL), de acordo com as instruções do fabricante, tomando a albumina de soro bovino como referência padrão.

Ensaio de Catálise

Foi ensaiado de acordo com o método anterior63. A mistura de reação (450 μl) em uma cubeta de quartzo continha 50 μl de lisado de células (60 μg), 250 μl de tampão fosfato 50 mM (pH 7,0). A reação foi iniciada com a adição de 150 μl de 30 mM H2O2 (10 mM final). A diminuição da absorvância a 240 nm foi monitorizada durante 2 min num espectrofotómetro Genesys 10 S UV-Vis (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). A atividade enzimática foi calculada usando o coeficiente de extinção de 0,00706 por mmol por mmol e a unidade de atividade enzimática foi expressa como mmol H2O2 decomposto por minuto por mg de proteína. Em seguida, a atividade enzimática das amostras tratadas foi comparada com o controle (100%).

ensaioGPx

Foi testada de acordo com o procedimento publicado64. A mistura de reação (500 μl) continha 1 mM GSH, 0,15 mM NADPH, 0,12 unidade de glutationa redutase (GR), 0,1 mM azida de sódio em 0,1 M de fosfato de potássio (pH 7,0 com 1 mM EDTA. A azida sódica foi adicionada à mistura de reação para inibir a atividade catalítica endógena. A mistura de reação foi incubada com 60 μg de amostra durante 10 min sem NADPH, e a reação foi iniciada com a adição de NADPH e H2O2 a uma concentração final de 150 μM. A taxa de consumo de NADPH foi monitorizada a 340 nm durante 3 min. Uma unidade de atividade do GPx foi definida como a quantidade de enzima necessária para consumir 1 μmol de NADPH/min no ensaio acoplado e a atividade foi expressa por mg de proteína. Então a atividade enzimática das amostras tratadas foi comparada com o controle (100%).

Análise estatística

Os resultados experimentais (n = número de poços agrupados de pelo menos dois experimentos diferentes) foram apresentados como a média ± SEM. Todos os gráficos de barra foram plotados usando um GraphPad Prism Software, versão 3.00 (San Diego, CA). Os dados foram analisados para significância por ANOVA unidirecional e depois comparados usando os testes de comparação múltipla de Dunnett ou Bonferroni. Os valores dos testes P < 0,05 e P < 0,01 foram considerados significativos e altamente significativos, respectivamente.