RNase A: Perguntas Mais Frequentes | AG Scientific Blog

Introdução ao RNase

Ribonucleases (RNases) são um grande grupo de enzimas hidrolíticas que degradam moléculas de ácido ribonucleico (RNA). Estas são nucleases que catalisam a decomposição do RNA em componentes menores. Eles são uma superfamília de enzimas que catalisam a degradação do RNA, operando nos níveis de transcrição e tradução.

3D conformação de ribonuclease A enzyme

Estas enzimas estão presentes em todas as células vivas e fluidos biológicos, incluindo procariotas e eucariotas, e desempenham muitas funções importantes. RNases são onipresentes, com uma vida útil muito curta em um ambiente desprotegido. Os efeitos citotóxicos incluem a clivagem do RNA que leva à inibição da síntese de proteínas e à indução da apoptose. Estes efeitos citotóxicos podem ser produzidos pela aplicação de RNase na superfície externa da célula, mas verificou-se que a citotoxicidade aumenta 1000 vezes quando a enzima é introduzida artificialmente no citosol, indicando a internalização na célula como o passo limitador da taxa de toxicidade.

RNases são classificadas como endoribonucleases e exoribonucleases. Endoribonucleases são formas A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM, e V.

Exoribonucleases incluem as formas PH, II, R, D, e T do RNase, assim como a polinucleotídeo fosforilase (PNPase), oligoribonuclease, exoribonuclease I e exoribonuclease II. Estas enzimas clivam diferentes espécies de RNA.

Recentemente, os pesquisadores têm prestado atenção às RNases como possíveis agentes para o tratamento do câncer. A idéia é encontrar uma enzima que danifique seletivamente as células cancerosas sem afetar as células normais ao redor.

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Perguntas frequentes sobre o RNase A

O que é o RNase A?

Ribonuclease A é uma enzima digestiva secretada pelo pâncreas que especificamente “digere” ou hidrolisa polímeros de RNA (mas não DNA) por clivagem de endonuclease das ligações fosfodiéster formando as ligações covalentes entre os resíduos de ribonucleotídeos adjacentes nestas moléculas.

O que significa “A” no RNase A?

O “A” no seu nome não se refere à especificidade do substrato, mas à forma predominante da enzima produzida pelo pâncreas bovino. A RNase A não é modificada, enquanto RNase B, RNase C e RNase D são misturas de glicoformas.

Por causa de sua disponibilidade em grande quantidade e alta pureza, a RNase A tem sido objeto de um trabalho marcante na química de proteínas e enzimologia. Além disso, variantes citotóxicas e homólogos da enzima têm demonstrado utilidade como agentes quimioterápicos.

Qual é a história desta enzima?

Foi usada por Christian Anfinsen para provar que a sequência de aminoácidos, determina a estrutura de uma proteína dobrada e foi usada por Stanford Moore e William Stein para mostrar que um arranjo específico de aminoácidos é usado no centro catalítico das enzimas.

Ribonuclease A também foi a primeira enzima sintetizada por R. Bruce Merrifield, mostrando que moléculas biológicas são simplesmente entidades químicas que podem ser construídas artificialmente. Todos estes conceitos centrais, descobertos com a ajuda da ribonuclease, foram premiados com prêmios Nobel.

Qual é a estrutura do RNase A?

Estrutura do RNase

A relativamente pequena sequência de 124 aminoácidos do RNase A que tem uma massa molecular de 12.600 Da. contém quatro dos seus resíduos, dois dos resíduos His12 e His119 estão directamente implicados como resíduos catalíticos desta enzima. O anel imidazol de His12 tem um valor anonimamente baixo de pK (pK < 6.0) sugerindo que ele deve ser desprotonado para catálise. Por outro lado, o anel imidazol de His119 tem um valor anonimamente alto de pK (pK > 6.0) sugerindo que deve ser protonado para catálise.

Is Ribonuclease A a protein?

RNase A é uma proteína pequena, a enzima madura tem apenas 124 resíduos de aminoácidos, sem carboidratos ligados. Ao contrário de outras enzimas, a RNase A contém 19 dos 20 ácidos, faltando apenas o triptofano.

Qual é o mecanismo de ação?

A sua12 atua como base geral, aceitando o próton 2′-OH do anel de açúcar ribonucleico sésseis. Isto promove um ataque nucleófilo pelo 2′-O no átomo de fósforo (P) mais positivo, criando assim um ribonucleótido 2′-,3′-cíclico intermediário de fosfato. A criação deste intermediário é facilitada pelo imidazol de His119 que atua como um ácido geral, doando seu próton ao átomo de oxigênio na ligação susceptível de P-O-R’.

Para o segundo passo da reação, as atividades do ácido geral e da base das cadeias laterais destes dois resíduos de His são revertidas. O His12 atua como ácido geral, doando seu próton recém-adquirido ao intermediário 2′-,3′-cíclico de ribonucleotídeo fosfato, enquanto o His119 que atua como base geral, aceitando um próton da água para promover o ataque de hidroxila sobre o mesmo intermediário 2′-,3′-cíclico.

Qual é o local de clivagem do RNase A?

RNase A hidrolisa eficientemente contaminantes de RNA em preparações de DNA, clivando a ligação fosfodiéster entre o grupo 3′-fosfato de um nucleotídeo pirimidina (C e U) e a 5′-ribose do seu nucleotídeo adjacente 1, 2, 3. O fosfodiéster 2′-,3′-cíclico intermediário que é gerado é então mais hidrolisado para um grupo de 3′- monofosfato. A RNase A pancreática bovina é uma proteína muito estável de 124 aminoácidos com sua maior atividade medida em direção ao RNA de cadeia única e uma taxa de clivagem duas vezes mais rápida em resíduos de cidina comparado com resíduos de uridil.

Qual é a reação de catálise ácida/base da RNase A?

RNase A também usa catálise ácida/base para mudar quimicamente seus substratos. Resíduos ácidos ou básicos dos prótons de transferência enzimática de ou para o reagente a fim de estabilizar as cargas em desenvolvimento no estado de transição. A transferência de prótons geralmente cria melhores grupos de saída, tornando a reação mais favorável energeticamente.

Histidina é um resíduo de aminoácido muito comum envolvido na catálise, pois a histidina tem um valor pKa próximo do neutro, (pKa=6); portanto, a histidina pode aceitar e doar prótons a pH fisiológico.

Qual a estabilidade da Ribonuclease A?

Ribonuclease A é surpreendentemente estável. Por exemplo, num procedimento de purificação da ribonuclease A do pâncreas de vaca, os extractos são tratados com ácido sulfúrico e depois aquecidos quase até à ebulição, e a ribonuclease A é a única coisa que sobrevive. Isto não é surpreendente, já que é segregado pelo pâncreas e precisa realizar seu trabalho no ambiente inóspito do trato digestivo. A estabilidade da ribonuclease A deve-se em grande parte a quatro ligações de dissulfureto que colam diferentes partes da cadeia.

Em geral, para manter a estabilidade, armazenar e manusear o produto de acordo com as instruções do fornecedor.

Como é que o RNase A está inactivado?

RNase A é uma enzima bastante estável e contém 4 pontes de dissulfureto, que ocorrem em todas as ribonucleases pancreáticas de mamíferos. Quando as pontes são quebradas de forma redutora a proteína é desnaturada e fica inativa. Na reoxidação a proteína se redobra e a atividade completa é restaurada. É possível, no entanto, reduzir as pontes apenas parcialmente e reter a actividade enzimática. A remoção de 4 peptídeos no terminal carboxil destrói a atividade enzimática.

O que inibe a RNase A?

Uridina vanadate é um potente inibidor competitivo da RNase A. O que a torna tão potente é o fato de sua estrutura imitar um estado de transição que é intermediário na reação.

Como é preparado o RNase A a partir do estoque?

RNase A é tipicamente preparado fervendo o estoque por 10 minutos para eliminar a atividade contaminante do DNase sem afetar o RNase. Aquecimento a 65°C não afetará o RNase.

Como reconstituir a reserva preparada de RNase A?

RNase A pode ser dissolvido a uma concentração de 1 a 10 mg/ml em 10 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, aquecido a 100°C por 15 minutos para inativar DNases contaminantes e resfriado lentamente até a temperatura ambiente e distribuir em alíquotas.

Qual é a concentração de trabalho desta enzima?

Concentração de trabalho recomendada da RNase A é de 1 a 100 µg/ml, dependendo da aplicação. A enzima é ativa sob uma ampla gama de condições de reação. A baixas concentrações de sal (0 a 100 mM NaCl), o RNase A cliva o RNA de corda simples e dupla, bem como o RNA de corda em híbridos de RNA-DNA.

Qual é a temperatura de armazenamento e medidas de manuseamento deste produto?

Coloque em frasco hermeticamente fechado a -20ºC. Uma vez aberto, desidratar sobre sílica gel sob vácuo antes de voltar a -20ºC. Tenha cuidado ao manuseá-lo. Não utilize este composto se não estiver totalmente treinado ou não estiver consciente dos perigos envolvidos.

Quais são as aplicações do RNase A?

RNases têm papéis importantes na degradação do RNA e na rotação em todos os organismos. A enzima Ribonuclease pode desenrolar a hélice do RNA ao complexar com RNA de cadeia única.

RNase A é uma endoribonuclease com funções no metabolismo do RNA e regulação da expressão gênica.

RNase A tem desempenhado papéis importantes em doenças como doenças auto-imunes, insuficiências renais e distúrbios do pâncreas. Mais recentemente, também foi relatada uma atividade antitumoral para uma RNase A com propriedades citotóxicas e citostáticas. Os membros da superfamília RNase A são amplamente expressos e presentes em soro e tecidos de mamíferos.

A enzima pode ser usada para hidrolisar o RNA a partir de amostras de proteínas. É compatível para uso em ensaios de proteção RNase, para remover RNA não ligado especificamente, na análise de seqüências de RNA, para hidrolisar RNA contido em amostras de proteína, e na purificação do DNA.

Qual é a aparência/forma deste produto?

Fornecido como um pó branco cromatograficamente purificado, sem sal, liofilizado. A aparência/forma do produto pode variar de acordo com o fabricante.

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