- Caracterização de TMC quimicamente sintetizado e PEG-HA
- Análise de viscosidade dinâmica e resultados de inversão de tubos (termo-responsividade das formulações de hidrogel)
- Estudo reológico
- Estudo de inchaço (pH-responsividade das formulações de hidrogel)
- Estudo de degradação do hidrogel sob agitação mecânica (teste de estabilidade mecânica)
- SEM e estudo TEM de formulações de hidrogel
- Estudo de hidrogelSAXS
- Potencial zeta das formulações de hidrogel
- Estudo FTIR de hidrogel carregado com droga
- Estudo de liberação cumulativa
Caracterização de TMC quimicamente sintetizado e PEG-HA
Os espectros 1H-NMR de TMC e quitosano são mostrados na Fig. 2A, onde a quitosana mostrou picos de 2,68 ppm para H-2 e picos múltiplos na faixa de 3,85-3,55 ppm para H-3 a H-6. O pico para o grupo N-trimetil (-NMe3) do TMC foi detectado a 3,36 ppm confirmando a presença de N-metilação e referindo-se a locais quaternizados. Junto com a produção de TMC por N-metilação em uma etapa, um derivado modificado de quitosana com NMe2 (2,28 ppm) foi sintetizado como um produto secundário.
1H Espectros de NMR de quitosano e TMC (A); HA e PEG-HA (B).
Como mostrado na Fig. 2B, HA mostrou um pico de 3,21 ppm para o H glicosídico e um pico de 1,89 ppm para o H eetílico. HA após reação com OMe-PEG2000-NH2 mostrou um pico de etileno H (3,60 ppm) e o (-NH-CH2-CH2-O-) H pico (2,76 ppm) do OMe-PEG2000-NH2, indicando que o PEG-HA foi formado com sucesso por uma reação de acoplamento amida (Fig. 2B). Outros picos de PEG-HA são muito semelhantes aos de HA.
Os espectros FT-IR de quitosano e TMC são mostrados na Fig. 3A. O TMC mostrou os picos característicos: Alongamento O-H/N-H (3431 cm-1); Alongamento C-H, anel de piranose (2919 cm-1); Alongamento C=O, amida de NH-Ac (1654 cm-1); Alongamento C-H, metílico de TMC (1503 cm-1); Dobra C-H, CH3CO (1390 cm-1); e Alongamento C-O-C (1158, 1066 cm-1). A Figura 3A mostra que os picos espectrais do quitosano são semelhantes aos do TMC. A quitosana mostrou alongamento O-H/N-H em 3421 cm-1, alongamento C-H do anel piramidal em 2880 cm-1, alongamento C=O da amida de NH-Ac em 1654 cm-1, curvatura C-H de CH3CO em 1390 cm-1 e alongamento C-O-C em 1155 e 1078 cm-1. O pico a 1503 cm-1 para as ligações C-H dos grupos metílicos em TMC corresponde à adição de grupos trimetil aos grupos aminados de quitosano.
FTIR espectros de quitosano e TMC (A); HA e PEG-HA (B).
Os picos característicos FTIR do PEG-HA mostrados na Fig. 3B são alongamento O-H (3428 cm-1), alongamento C-H, anel piranose (2892 cm-1), alongamento C=O, NH-Ac (1644 cm-1), e alongamento C-N (1473 cm-1). HA mostrou picos característicos similares aos do PEG-HA e os picos espectrais de HA são alongamento O-H (3438 cm-1); alongamento C-H, anel de piranose (2899 cm-1); e alongamento C=O, NH-Ac (1615 cm-1). O pico encontrado em 1473 cm-1 para PEG-HA indica acoplamento amida de HA com OMe-PEG2000-NH2.
Análise de viscosidade dinâmica e resultados de inversão de tubos (termo-responsividade das formulações de hidrogel)
Neste estudo, os valores de viscosidade dinâmica das formulações foram medidos em função da temperatura com uma taxa fixa de cisalhamento de 85 s-1, e a conversão da fase sol para a fase gel com a temperatura está representada na Fig. 4I. Os valores de viscosidade dinâmica (Pa.s) das formulações de hidrogel carregadas com ácido gálico PF127/TMC/PEG-HA e PF127 mudaram gradualmente com o aumento da temperatura na faixa de 5-50 °C, e a partir do ponto de inflexão, ambas as formulações mostraram claramente uma transição sol-gel a 37 °C. Além disso, o conteúdo de PF127 de ambas as formulações foi de 13,5 wt% do peso total das formulações de hidrogel, e ambas as amostras mostraram uma temperatura de gelificação de 37 °C. Os valores de viscosidade dinâmica dos hidrogéis PF127/TMC/PEG-HA e PF127 a 37 °C foram de 7,02 Pa.s e 5,6 Pa.s, respectivamente. O maior valor de viscosidade dinâmica do PF127/TMC/PEG-HA do que do PF127 a 37 °C foi devido à adição de TMC e PEG-HA no sistema hidrogel baseado no PF127 e que criou interações inter-micelares melhoradas aumentando a hidrofobicidade de todo o sistema1. Além disso, o maior valor de viscosidade dinâmica do hidrogel PF127/TMC/PEG-HA no ponto de gelificação sugeriu uma melhor resistência à deformação sob estresse. Na literatura, o PF127 atua como um fluido não newtoniano na fase de gel (37°C) e os valores de viscosidade dinâmica variaram em função da taxa de cisalhamento52. O PF127 na fase sol-phase agiu como um fluido newtoniano52. No presente estudo, os valores de viscosidade dinâmica das formulações na fase sol a 5 °C foram de 0,40 Pa.s e 0,32 Pa.s para PF127/TMC/PEG-HA e PF127, respectivamente, que estão em boa concordância com os valores relatados anteriormente na literatura52,
O método de inversão de tubo foi aplicado para visualizar a gelificação com mudança de temperatura medindo a fluidez do PF127/TMC/PEG-HA e o sistema mostrou gelação reversível com transição sol-gel a 37 °C. As cadeias PF127 juntamente com dois outros compostos (TMC e PEG-HA) usam a temperatura como gatilho e formam hidrogel através da ligação física reversível das cadeias de polímeros53. Os hidrogéis revertem ao estado de solução depois que o estímulo térmico é removido. A agregação inter-micelar de polímeros termo-responsivos próximo à temperatura de gelificação mostra uma mudança positiva de entropia (ΔS) e uma mudança negativa de energia livre (ΔG) de agregação54. As associações água-água causam um aumento na entropia conhecido como efeito hidrofóbico, que é a força guia para a formação do gel no LCST54,
Estudo reológico
Os parâmetros reológicos das formulações, nomeadamente, viscosidade complexa (Fig. 5I), módulo de armazenamento (Fig. 5II), e módulo de perda (Fig. 5III) foram ilustrados como a função da temperatura. Como mostrado na Figura 5, todos os parâmetros reológicos são altamente dependentes da temperatura e a conversão sol-gel de ambas as formulações foi encontrada para ser iniciada perto de 30 °C como obtido a partir do ponto de inflexão dos gráficos. Após a formação do gel, todos os parâmetros reológicos de ambas as formulações são encontrados muito superiores à sua fase sol. Os valores de viscosidade complexa (I), módulo de armazenamento (II) e módulo de perda (III) do PF127/TMC/PEG-HA são significativamente maiores que os do PF127 em seu estado gel, indicando que o hidrogel PF127 modificado com TMC e PEG-HA são mecanicamente mais fortes que os hidrogéis PF127. Os parâmetros reológicos melhorados do PF127/TMC/PEG-HA hidrogel podem ocorrer devido a fortes interações inter-micelares e o TMC e PEG-HA possivelmente aumentariam a estabilidade das micelas formadas pelo PF127 no hidrogel.
Estudo de inchaço (pH-responsividade das formulações de hidrogel)
O inchaço de partículas de hidrogel liofilizadas sob pH ácido (pH 5,4) usando tampão acetato 0,1 M contra o tempo (Fig. 6) a 30 °C revelou que as partículas de gel formadas pelo PF127/TMC/PEG-HA no estado inchado resistiram à dissolução completa até 30 min e então, começaram a ser dissolvidas na mídia para se degradarem completamente logo após 2 h. Em contraste, o PF127 no estado inchado resistiu à degradação até 15 min e foi completamente degradado após 1 h. A hidrofilicidade do PF127 foi aumentada sob condições ácidas devido à interação polímero-água, o que resultou na rápida dissolução da estrutura do gel21. O pH-responsividade das partículas de hidrogel liofilizado foi modificado após a adição de TMC e PEG-HA no sistema, e o aumento da interação inter-micelar do sistema de hidrogel modificado tornou resistente à degradação/dissolução mediada por ácido das partículas de gel por um tempo maior.
O inchaço das partículas de gel sob pH neutro (7,4) usando PBS 0,1 M a 30 °C revelou que as partículas de hidrogel permaneceram inchadas por 4 h sem qualquer evidência de dissolução. A razão de inchaço do PF127/TMC/PEG-HA (5,01) a pH 7,4 após 4 h foi maior que a do PF127 (4,23) indicando que a rede porosa interligada de PF127/TMC/PEG-HA acumulou mais moléculas de água em sua estrutura no estado inchado (Fig. 6).
Estudo de degradação do hidrogel sob agitação mecânica (teste de estabilidade mecânica)
O estudo de degradação do hidrogel de PF127/TMC/PEG-HA e PF127 sob agitação mecânica (70 rpm) por 14 dias em condições de pH neural indicou que o PF127/TMC/PEG-HA resistiu à degradação do gel em maior extensão do que o PF127 hidrogel (Fig. 7). O hidrogel feito de PF127/TMC/PEG-HA mostrou uma massa remanescente de 45,4% após agitação mecânica por 14 dias, enquanto o sistema PF127 mostrou maior perda de massa após 14 dias (massa remanescente de 39,2%). Portanto, a estabilidade mecânica do hidrogel foi aumentada após a adição de TMC e PEG-HA às cadeias de polímeros PF127 na formulação porque uma estrutura de hidrogel mais interligada foi formada por esta modificação.
SEM e estudo TEM de formulações de hidrogel
As imagens SEM de PF127 carregado com ácido gálico (Fig. 8A,B) e PF127/TMC/PEG-HA (Fig. 8C,D) hidrogéis no estado liofilizado mostram estruturas porosas aglomeradas com tamanhos irregulares de poros após a liofilização, pois a remoção da água fez com que todas as redes interligadas no hidrogel se empilhassem. Entretanto, a imagem do PF127/TMC/PEG-HA (caixa azul ampliada da Fig. 8C) na Fig. 8D exibe uma rede interconectada melhor com poros mais distintos do que apenas o PF127 (caixa vermelha ampliada da Fig. 8A), pois as interações inter-micelares das cadeias PF127 foram melhoradas após a modificação com o TMC e o PEG-HA55. A droga carregada dentro do hidrogel foi relativamente mais favoravelmente distribuída dentro da estrutura em gel do PF127/TMC/PEG-HA e a liberação sustentada e controlada da droga foi melhor no sistema PF127 modificado devido à estrutura porosa mais interligada na formulação original.
As imagens TEM do PF127 (Fig. 8A). 8E) e PF127/TMC/PEG-HA (Fig. 8F) no estado sol mostram agregados micelares/ micelas interconectadas variando de 100 a 1000 nm de tamanho que aparecem nas imagens como grânulos de formas variadas como indicado pelos círculos pontilhados vermelhos na Fig. 8E e os círculos pontilhados azuis na Fig. 8F. Como mostrado na Fig. 8, as micelas formadas em PF127/TMC/PEG-HA (F) eram mais compactas e estáveis que as feitas somente de PF127 (E). As micelas foram formadas principalmente por cadeias de polímeros PF127, e o TMC e o PEG-HA na formulação PF127/TMC/PEG-HA influenciaram a formação de estruturas inter-micelares estáveis e compactas ou agregados micelares de PF127 através da interação hidrofóbica. Portanto, o sistema de liberação feito de PF127/TMC/PEG-HA hidrogel poderia mostrar boa liberação de drogas devido às suas estruturas inter-micelares estáveis.
Estudo de hidrogelSAXS
A forma liofilizada dos hidrogéis revestidos na placa de vidro foi colocada paralelamente ao suporte de amostras no instrumento para reflexão SAXS. Como mostrado na Fig. 9, os valores de I (a. u.) das amostras de hidrogel foram plotados contra q (Å-1). O SAXS em modo de reflexão é feito quando o raio X atinge uma amostra plana quase paralela à superfície e dá a idéia de não homogeneidade da rede de hidrogel56. O gráfico de I (a. u.) vs q (Å-1) na Fig. 9 mostrou um pico de aparência em q = 0.02 Å-1 que é observado em hidrogéis indicando a presença de não homogeneidade congelada e isto é devido à presença de região cristalizada de alta densidade de elétrons originada pelos defeitos inerentes à rede de hidrogéis57.
Reflexão SAXS pela medida I (a. u.) vs q (Å-1) de medicamentos carregados (A) PF127 e (B) PF127/TMC/PEG-HA hidrogel.
Potencial zeta das formulações de hidrogel
O potencial zeta das formulações na fase sol foi medido durante 14 dias para monitorar a estabilidade dos componentes no sistema durante o armazenamento. A carga superficial dos componentes na formulação determina sua estabilidade, solubilidade e folga58 , e a carga superficial de um componente é medida pelo potencial zeta. Tanto as formulações PF127 como PF127/TMC/PEG-HA com fármaco (ácido gálico) na fase sol apresentam valores negativos de potencial zeta (Tabela 1). O PF127 na fase sol com ácido gálico carregado mostrou um potencial zeta negativo de -18,7 mV ± 6,1 a 30 °C e o PF127/TMC/PEG-HA com droga (ácido gálico) na fase sol mostrou um potencial zeta negativo de -16,3 mV ± 5,9. Como mostrado na Tabela 1, os valores de potencial zeta de PF127 e PF127/TMC/PEG-HA foram de -18,7 mV ± 6,5 e -14,6 mV ± 7,7, respectivamente, após 14 dias de armazenamento a 30 °C. Portanto, todos os componentes nas formulações foram distribuídos uniformemente no sistema sem precipitação, pois não foi encontrada alteração significativa nos valores de potencial zeta para ambas as formulações durante o período de armazenamento. Além disso, as cargas superficiais das micelas não são alteradas significativamente na formulação PF127/TMC/PEG-HA, pois TMC e PEG-HA são carregados de forma oposta e, portanto, o potencial zeta resultante do PF127/TMC/PEG-HA é similar ao potencial zeta da formulação com PF127 apenas.
Estudo FTIR de hidrogel carregado com droga
Figure 10 mostra os picos característicos FTIR de PF127/TMC/PEG-HA hidrogel carregado com ácido gálico na forma liofilizada (cm-1), e estes picos são 3445 (alongamento O-H), PF127, TMC, PEG-HA, e ácido gálico); 2891 (estiramento C-H), PF127, TMC, PEG-HA e ácido gálico; 1644 (estiramento C=O), TMC e PEG-HA; 1282 (estiramento C-O-C), PF127, TMC e PEG-HA; 1110 (estiramento C-C-O simétrico) PF127; 964 (estiramento C-C-O assimétrico), PF127. Picos característicos similares foram observados a partir da análise FTIR do hidrogel PF127 carregado com ácido gálico. Os picos FTIR do hidrogel PF127 carregado com ácido gálico na forma liofilizada são 3445 cm-1 (estiramento O-H), PF127 e ácido gálico; 2891 cm-1 (estiramento C-H), PF127 e ácido gálico; 1282 cm-1 (estiramento C-O-C), PF127; 1110 (estiramento C-C-O simétrico) PF127; e 964 (estiramento C-C-O assimétrico), PF127. O amplo pico encontrado em 3445 cm-1 de ambas as formulações de hidrogel sugere que o ácido gálico foi efetivamente carregado nos hidrogéis.
FTIR espectros de hidrogel de dupla resposta (pH/temperatura) PF127 e PF127/TMC/PEG-HA.
Estudo de liberação cumulativa
O estudo de liberação foi realizado para examinar a liberação de ácido gálico de PF127/TMC/PEG-HA e PF127 hidrogéis em hidrólises de 0,1 M PBS (pH 7,4) e a 37 °C (Fig. 11). Ambas as formulações mostraram uma liberação de ácido gálico em um estágio inicial (dentro de 5 h) com 64,60% ± 1,112 e 50,31% ± 0,411 liberação do fármaco PF127/TMC/PEG-HA e PF127 hidrogéis, respectivamente. Após 5 dias, uma liberação cumulativa de medicamento de 87,61% ± 1,112 e 75,20% ± 0.850 foi registrado para PF127/TMC/PEG-HA e PF127 hidrogéis, respectivamente, indicando que o sistema de hidrogel modificado feito de PF127 com TMC e PEG-HA funcionava melhor como um sistema de distribuição de drogas. As alterações morfológicas do PF127/TMC/PEG-HA, tais como interações inter-micelares aprimoradas e uma estrutura de rede porosa bem formada melhoraram a liberação do fármaco sob condições de pH neutro.
Liberação cumulativa (%) do fármaco (ácido gálico) de (A) PF127 e (B) PF127/TMC/PEG-HA hidrogel a pH 7,4 e 37 °C durante 5 dias em tampão PBS 0,1 (M). Os dados representam a média dos experimentos de liberação triplicada ± SD e ajuste dos dados de liberação de drogas para três modelos de taxa diferente de ordem zero, primeira ordem e Higuchi.
Figure 11 Os valores cumulativos de liberação de drogas (ácido gálico) dos hidrogéis são ajustados com diferentes modelos de taxa cinética (Fig. 11), e as constantes de taxa dos diferentes modelos de taxa para todas as variedades de hidrogel são tabuladas na Tabela 2. O ajuste dos dados de liberação para vários modelos de taxa são expressos em valores R2 (Fig. 11).
O modelo de taxa de ordem zero é dado pela equação:
onde Qt é a quantidade cumulativa de liberação de droga do hidrogel no tempo t (h), Qo é a quantidade inicial de droga carregada no hidrogel, e k0 é a constante de taxa de ordem zero (seg-1). A taxa de liberação de droga por equação de taxa de ordem zero é independente da quantidade inicial da droga carregada no hidrogel.
O modelo de taxa de primeira ordem é dado pela seguinte forma não-linear:
onde Qt é a quantidade cumulativa de liberação de droga do hidrogel no momento t (h), Qo é a quantidade inicial de droga carregada no hidrogel, e k1 é a constante de taxa de primeira ordem (seg-1). A taxa de liberação de droga pela equação de taxa de primeira ordem é dependente da sua concentração (a quantidade inicial de droga carregada no hidrogel).
Equação de taxa Higuchi sugere liberação de droga de hidrogel pelo método de difusão e a forma não linear da equação de taxa Higuchi é:
onde Qt é a quantidade cumulativa de liberação de droga do hidrogel no tempo t (h), e kH é a constante Higuchi (seg-0.5).
O ajuste dos dados de liberação aos diferentes modelos de taxa (Fig. 11) indica que a taxa de liberação de drogas das formulações de hidrogel segue de perto a equação de taxa de primeira ordem como ambos os hidrogéis PF127 carregados com ácido gálico e PF127/TMC/PEG-HA mostram valores R2 de 0,990 que são maiores que aqueles obtidos de outros modelos de taxa usados neste estudo. Portanto, a taxa de liberação de drogas dos hidrogéis é dependente da concentração inicial da droga carregada nos hidrogéis. Como encontrado na Tabela 2, k1 (seg-1) é menor que outras constantes de taxa para ambas as variedades de hidrogéis, e assim, a liberação sustentada de droga do hidrogel segue mais de perto o modelo de taxa de primeira ordem do que qualquer outro modelo de taxa usado aqui.