Instrumento e reagentes
O instrumento para detecção de MTX foi o Siemens VIVA-E que permite a personalização de parâmetros através da disponibilidade de canal aberto. Os reagentes e calibradores MTX foram adquiridos da Siemens (6L119UL).
Três níveis de material de Controle de Qualidade (CQ) foram adquiridos da Bio-Rad (Irvine, CA), um material de CQ adicional personalizado a 0,05 μmol/L da Aladdin (Xangai, China).
A comparação do método MTX foi realizada analisando as mesmas amostras usando o ensaio de Cromatografia Líquida-Tandem Espectrometria de Massa (LC-MS/MS) (LC-20 AD Cromatografia Líquida, e AB SCIEX QTRAP®4500 Espectrômetros de Massa).
Especimes
As amostras de teste foram obtidas da ala hematológica do hospital infantil Dalian. Algumas amostras testadas e amostras de plasma ictérico livre de MTX foram coletadas para estudo da interferência de triglicérides e bilirrubinas. Não houve intervenção no tratamento dos pacientes, e nenhuma informação individual do paciente foi mencionada.
Preparação do reagente
O kit de reagentes Siemens contém o reagente de anticorpos/substrato A, o reagente enzimático B, o concentrado tampão de ensaio de drogas de emissão e os calibradores de emissão de metotrexato. Os reagentes A e B foram reconstituídos com 3,0 mL de água desionizada, misturados por um suave redemoinho, e equilibrados à temperatura ambiente durante 1 h. O concentrado tampão MTX foi misturado com água desionizada (1:15 v/v). Solução de trabalho dos reagentes A e B foi preparada diluindo soluções de reserva 1:9 v/v com solução tampão.
alguns calibradores (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/L) foram reconstituídos para a concentração indicada com 1.0 mL de água deionizada de acordo com as instruções do fabricante, outros calibradores 1,50 e 2,00 μmol/L foram reconstituídos para 1,00 μmol/L com 1,50 e 2,00 mL de água deionizada respectivamente. Então o calibrador 0,20 μmol/L foi diluído em 0,05 μmol/L, e o 1,00 μmol/L foi diluído em 0,10 e 0,25 μmol/L. O novo conjunto de calibradores (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 e 1,00 μmol/L) cumpre os requisitos da curva de calibração modificada.
Programação do instrumento Viva-E
Um canal aberto no Viva-E foi programado para alterar os volumes de reagentes A & B de 180 μL para 110 μL (110 μL é o limite inferior do Viva-E para os reagentes MTX). Uma curva de calibração de seis pontos foi programada com regressão cúbica spline modificada. Os seis calibradores fornecidos pelo Kit foram 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 e 2,00 μmol/L. Quando os volumes dos reagentes A e B foram reduzidos, eles não foram suficientes para reagir com amostras superiores a 1 μmol/L. Como resultado, o novo conjunto calibrador do ensaio EMIT modificado foi alterado para 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L dentro de um intervalo de 0,05 a 1,00 μmol/L.
De acordo com as instruções do kit comercial, as amostras de concentração superior a 1,00 μmol/L devem ser diluídas no âmbito da curva de calibração (0.05-1.00 μmol/L) usando factor de diluição de 10, 100 ou 1000.
Limite de branco, limite de detecção, limite de quantificação
Limite de branco (LOB), limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ) foram determinados de acordo com CLSI EP17-A . O LOB foi testado utilizando seis amostras (S1-S6, 10 réplicas em 10 dias): S1 e S2 foram calibradores zero de dois lotes diferentes de calibradores, S3 e S4 foram diluentes, S5 e S6 foram plasma em branco. O LOD foi testado com 5 lotes de amostras de baixo nível, variando do LOB até quatro vezes o LOB (12 réplicas em 12 dias). O LOB e o LOD foram determinados por dois lotes de reagentes. De acordo com os requisitos clínicos, a meta para o erro total foi definida para 20%. Os resultados do estudo LOD foram usados para estimar o viés e a imprecisão para cada nível do analito. Estes dados foram então combinados para estimar o erro total em cada nível e determinar o limite de quantificação (LOQ).
Imprecisão intradiária e inter-dia
Imprecisão intradiária (n = 10) do ensaio modificado foi avaliada por um nível de materiais de controlo (0,05 μmol/L) e três níveis de amostras de doentes (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L). Em cada nível, foram realizadas 10 réplicas. A imprecisão entre dias (n = 25) foi testada a estes 4 níveis em 5 dias consecutivos, e 5 réplicas para cada nível. Todas as amostras foram obtidas de diferentes pacientes. Os resultados medidos foram traçados contra os valores esperados.
Linearidade
A linearidade foi verificada diluindo o controle de qualidade de 2,00 μmol/L (hc) com tampão (c0) nas seguintes proporções: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0.33 μmol/L), 1hc + 9co (0.20 μmol/L), 1hc + 19co (0.10 μmol/L), 1hc + 39co (0.05 μmol/L). Cada diluição foi analisada três vezes, a equação de linearidade do ensaio modificado foi calculada com base nas médias dos resultados medidos e nos valores esperados.
O procedimento do ensaio LC-MS/MS
O ensaio LC-MS/MS realizado neste estudo é o seguinte A difenidramina foi utilizada como padrão interno. Acetonitrilo foi utilizado como precipitante sérico para eliminar albumina. Uma coluna Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm) foi utilizada para separações de LC. A fase móvel foi 0,1% de ácido fórmico e acetonitrilo. A eluição gradual foi realizada a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min a 30 °C. O modo de monitorização de reacções múltiplas (MRM) foi utilizado para detectar MTX e difenidramina na fonte de ionização por electrospray (ESI) e no modo de varrimento iónico positivo. MTX foi detectado em m/z 455,0 → 308,1, difenidramina foi detectada em m/z 256,0 → 167,0 .
Comparação do método
Seventa e nove amostras foram coletadas de pacientes com leucemia linfoblástica aguda no hospital Hematológico Ward of Dalian Children. Cada amostra foi testada usando o ensaio EMIT modificado e o ensaio LC-MS/MS, respectivamente. Os resultados foram comparados usando análise de regressão linear simples (MedCalc Statistical Software versão 15.6.1). Outras 45 amostras foram testadas usando o ensaio EMIT modificado e o ensaio EMIT comercial para comparação de métodos .
Estudos de interferência
Interferência de triglicérides foi avaliada através da preparação de amostras com Intralipid (20% de emulsão de gordura IV). A concentração de triglicérides nas amostras foi de 1000 ng/dL. Em seguida, foi realizado o teste Paired-T.
Interferência de bilirrubina foi simulada usando algumas amostras de plasma ictérico livre de MTX com concentração de bilirrubina não inferior a 30 mg/dL.
A interferência do metabolito 7-hidroxi-metotrexato estruturalmente relacionado foi avaliada pela adição de diferentes níveis de 7-hidroxi-metrexato às amostras de plasma, a concentração de MTX nessas amostras foi de 0,05 μmoL/L. E os resultados dos testes das amostras atuais foram comparados com os resultados das amostras originais .