Tabela 1
Excitação, emissão e brilho
Se você pretende usar múltiplas tags fluorescentes, é importante escolher uma com picos de emissão distintos – assim como picos de excitação que você pode visar com seus lasers disponíveis. Se os picos de emissão se sobrepõem, será difícil, ou possivelmente impossível, diferenciá-los.
Você normalmente quer a tag fluorescente mais brilhante dentro dos seus espectros disponíveis para alcançar um sinal claro e superar qualquer potencial fluorescente de fundo. Os valores de luminosidade são um produto do coeficiente de extinção da proteína e do rendimento quântico. No entanto, o número resultante pode ser difícil de interpretar, portanto, o brilho de uma tag fluorescente em relação a uma tag bem definida, como EGFP, é uma medida alternativa comum.
Maturação e branqueamento
Maturação define quanto tempo leva uma tag fluorescente a dobrar corretamente, formar o cromóforo e começar a fluorescer. Para eventos sensíveis ao tempo em células vivas, um tempo curto de maturação pode ser importante. Superfolder GFP (sfGFP), por exemplo, pode dobrar em menos de 10 minutos, enquanto mOrange pode levar mais de quatro horas.
Bleaching é uma medida de fotoestabilidade, ou seja, quanto tempo após a excitação o cromóforo perde a capacidade de emitir luz. Se você planeja realizar experimentos de longa duração, considere uma tag com uma alta fotoestabilidade. O T-sapphire tem uma semi-vida de branqueamento (t½; tempo para uma taxa inicial de emissão de x fotões/s para reduzir para metade) de 25 segundos, mas o EGFP é muito mais estável, com um branqueamento t½ de 174 segundos.
Condições ambientais
Como a maioria das proteínas, os tags fluorescentes são afectados pelo pH, temperatura e níveis de oxigénio. Dependendo do ambiente que pretende utilizar, pode ser necessário ajustar ligeiramente as condições ou seleccionar um tag mais apropriado.
O pH pode afectar os picos de excitação e emissão, e a maioria dos tags fluorescentes são sensíveis ao ácido: alguns podem mesmo alterar a intensidade fluorescente com as alterações do pH (por exemplo, pHTomato). O valor pKa é um bom indicador da sensibilidade do pH, pois mostra o pH em que metade dos cromóforos são fluorescentes.
Adicionalmente, a temperatura e os níveis de oxigénio afectam ambos os tempos de maturação: as condições hipóxicas tendem a atrasar os tempos de maturação, tal como as temperaturas fora da gama óptima das etiquetas fluorescentes (por exemplo, o EGFP foi optimizado para funcionar a 37°C). No entanto, novas etiquetas fluorescentes como a UnaG, uma GFP isolada da enguia japonesa de água doce (Anguilla japonica), fluoresce mesmo quando os níveis de oxigénio estão baixos3.
Otimização de códão
Como a maioria das etiquetas fluorescentes são derivadas de alforrecas ou proteínas de coral, em vez de algo como as células e tecidos de mamíferos em que é provável que você as use, pode haver uma diferença interespécies nos códons de aminoácidos utilizados. Isto pode levar a uma má expressão e, portanto, a um sinal baixo.
Felizmente, muitas das novas versões de tags fluorescentes foram otimizadas para refletir as preferências das células de mamíferos. Na GFP por exemplo, Jürgen Haas e colegas melhoraram o sinal 40-120 dobrando modificando a sequência de códon GFP4.
Se você estiver usando um plasmídeo mais antigo para gerar suas proteínas de fusão, ele pode não conter uma sequência modificada de tags fluorescentes. Como tal, verifique sempre se a sua sequência foi modificada para uso numa determinada espécie.
Oligomerização
É importante determinar se a sua tag é um monómero ou dímero (os monómeros são normalmente denotados por um “m” que prefira o nome da proteína, por exemplo mCherry), e se isto afecta ou não a sua experiência. Muitas das primeiras etiquetas fluorescentes eram propensas a formar oligómeros, e a oligomerização pode afectar a função biológica da proteína de fusão. EGFP, por exemplo, é um monômero que pode formar dímeros quando usado em concentrações altas o suficiente, o que pode distorcer organelas subcelulares5 ou interromper experimentos como o FRET6. FPs verdadeiramente monoméricos são recomendados na grande maioria dos casos.
GFP e produtos mCherry