Abstract
Glycogen phosphorylase is an important enzyme for carbohydrate metabolism in muscle. Ela utiliza fosfato inorgânico para remover a glicose do glicogênio, produzindo glucose-1-fosfato, que pode ser usado para a produção de ATP. A glicogênio fosforilase inativa (fosforilase h) é ativada ou pela ligação alérgica de 5′-AMP, ou pela fosforilação pela fosforilase quinase (PhK). A fosforilase a produz fosforilase a, que é ativa na ausência de AMP. PhK é a única cinase que pode fosforilase fosforilase b, que por sua vez é o único substrato para PhK. Esta pesquisa de dissertação tentou determinar as razões para esta especificidade e como estas duas enzimas se reconhecem, estudando mutantes de glicogênio fosforilase direcionados ao local; todos os mutantes foram testados para alterações em sua interação com uma forma truncada da subunidade catalítica da fosforilase quinase, gama(1–300). Três mutações (R69K, R69E e E501A), feitas em locais que interagem com o amino terminal da fosforilase b ou a, mostraram pouca diferença na fosforilação por gama(1–300) em relação à fosforilase b. Cinco mutações, feitas em três locais na cauda amino-terminal da fosforilase (K11A, K11E, I13G, R16A e R16E), contudo, produziram diminuições na eficiência catalítica por gama(1–300), em comparação com a fosforilase b. R16E foi o substrato mais pobre para a gama(1–300), dando uma diminuição de 47 vezes na eficiência catalítica. A amino-termo, e especialmente Arg 16, são fatores muito importantes para o reconhecimento da fosforilase por gama(1–300). Além disso, I13G e R16A foram capazes de ser fosforilados pela proteína quinase A, que não reconhece a fosforilase nativa; alguns dos mutantes também foram observados como tendo estados conformacionais alterados. R16A e R16E foram ativados a concentrações muito baixas de AMP e cristalizados a baixa temperatura, como a fosforilase a. Isto indica que mesmo sem fosforilação, suas estruturas são mais parecidas com a fosforilase a do que com a fosforilase b. Dois outros mutantes produziram o efeito oposto, comportando-se como a fosforilase b após a fosforilação. O R69E foi ativado apenas parcialmente pela fosforilação, e o I13G ficou completamente inativo após a fosforilação. I13G foi a primeira observação de uma forma de fosforilase que não podia ser ativada pela fosforilação.