Tumores Queratocísticos Odontogênicos: Factores Preditivos de Recorrência por Ki-67 e AgNOR Labelling

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Int J Med Sci 2012; 9(4):262-268. doi:10.7150/ijms.4243

Pesquisa Papel

Firat Selvi1 , Merva Soluk Tekkesin2, Sirmahan Cakarer1, S. Cemil Isler1, Cengizhan Keskin1

1. Universidade de Istambul, Faculdade de Odontologia, Departamento de Cirurgia Oral e Maxilofacial, Istambul, Turquia.

Propósito: O objetivo deste estudo foi investigar o possível papel das regiões organizadoras nucleolares Ki-67 e argirofílicas (AgNOR) entre os tumores queratocísticos odontogênicos recorrentes e não recorrentes (KCOTs). Outro objetivo foi comparar a correlação entre estes dois marcadores.

Materiais e Métodos: 22 KCOTs foram avaliados retrospectivamente. A atividade proliferativa real do KCOT foi medida pelo índice de rotulagem de Ki-67 e regiões organizadoras de nucleolares argirofílicos Contagem de AgNOR por núcleo. Resultados: A recidiva ocorreu em 3 pacientes (13,6%) durante o período de seguimento (seguimento médio, 37,8 meses). As contagens de Ki-67 e AgNOR foram significativamente maiores nas lesões recorrentes em comparação com as lesões não recorrentes. (p=0,045; p=0,049) A correlação entre as contagens de Ki-67 e AgNOR foi positiva (r=0,853 p=0,0001).

Conclusão: Dentro do limite do presente estudo, pensa-se que Ki-67 e AgNOR podem ser úteis como marcador prognóstico para as recidivas de KCOTs. Estes marcadores reforçaram o significado da nova classificação da lesão como um tumor odontogênico. A enucleação com curetagem ou descompressão após a enucleação com curetagem é um modelo cirúrgico simples e apropriado para o tratamento do KCOT apesar da relativa alta taxa de recidivas. Por outro lado, o tratamento conservador só pode ser escolhido se não houver invasão coronóide, lise cortical interruptiva e invasão tissular.

Introdução

Keratocystic odontogenic tumor (KCOT) definido pela Organização Mundial de Saúde (OMS), é uma neoplasia benigna, intra-óssea de origem dentária, com um revestimento característico de epitélio escamoso estratificado paraqueratinizado (1). O aumento da atividade do epitélio, foi confirmado por estudos anteriores que compararam os KCOTs com outros quistos odontogênicos pode explicar as altas taxas de recidiva dos KCOTs. Alguns estão associados à síndrome do carcinoma nevóide basocelular (2).

Estudos imunohistoquímicos examinaram os KCOTs usando vários marcadores de proliferação e de apoptose. A actividade proliferativa do revestimento epitelial dos KCOTs tem sido objecto de várias investigações, utilizando diferentes marcadores de proliferação como o Ki-67 (2). Ki-67 é a proteína nuclear relacionada com o ciclo celular prototípico, expressa pela proliferação de células em todas as fases do ciclo celular ativo. Ele se degrada rapidamente após a mitose, sendo uma meia-vida de antígeno detectável de uma hora ou menos (3). A detecção imunohistoquímica do Ki-67 tem sido usada para avaliar o potencial proliferativo de células saudáveis, bem como de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas (4).

Regiões organizadoras nucleolares (NORs) são loops de DNA que transcrevem o RNA ribossômico. A proteína relacionada à NOR torna-se visível no núcleo através de uma técnica de coloração de prata sob um microscópio de luz, e foi nomeada proteína argirofílica da NOR (Ag-NOR) (5). Vários métodos diferentes têm sido propostos para determinar a taxa proliferativa em tumores. A coloração com prata de AgNOR é considerada o melhor e mais econômico marcador para avaliar o comportamento proliferativo de uma lesão. A rapidez do turnover celular é avaliada pela velocidade do ciclo celular, de modo a avaliar a taxa de crescimento da lesão, que é facilmente avaliada pela contagem de AgNOR por núcleo. A quantidade de AgNOR representa um parâmetro da cinética celular e pode ser utilizada para fins de prognóstico. A contagem de AgNOR tem demonstrado oferecer um índice preditivo em várias malignidades (6,7).

O interesse dos patologistas nas proteínas AgNOR aumentou muito por volta do final dos anos 80, seguindo a observação de que as células malignas freqüentemente exibem uma quantidade maior de proteína AgNOR em comparação com as células benignas ou normais correspondentes. O método AgNOR tornou-se difundido entre patologistas, em vários campos da patologia tumoral (8).

O objetivo deste estudo foi investigar o comportamento clínico dos KCOTs em relação à recorrência, avaliando a coloração de Ki-67 e AgNOR. Outro objetivo foi investigar a correlação entre estes dois marcadores e demonstrar seu possível papel prognóstico nestas lesões.

Material e Métodos

Neste estudo, os KCOTs tratados por dois cirurgiões orais e maxilofaciais, de janeiro de 2004 a agosto de 2010, foram revistos retrospectivamente. Informações clínicas e histológicas foram registradas para cada paciente. O critério de inclusão do estudo foi o diagnóstico histopatológico do “KCOT”. Foram excluídos os casos que foram previamente tratados em outro serviço. Foram também excluídos do estudo os casos acompanhados há menos de 1 ano e que estavam associados à síndrome do carcinoma basocelular nevoóide (NBCCS). O diagnóstico histopatológico foi baseado nos critérios que mostram a paraqueratinização do epitélio do revestimento, conforme descrito pelas diretrizes da OMS (1).

De acordo com estes critérios, um total de 22 KCOTs histopatologicamente diagnosticados foram selecionados para o estudo. Foram utilizadas radiografias panorâmicas rotinas antes da operação. As tomografias também foram utilizadas de acordo com as características clínicas (tamanho, localização anatômica) do tumor. Os dados incluíram: idade ao diagnóstico, sexo dos pacientes, localização da lesão, manifestação clínica (dor, inchaço, infecção) modalidade de tratamento e recorrência (Tabela 1).

Todos os sujeitos foram avaliados clínica e radiograficamente em horários regulares. As radiografias panorâmicas foram realizadas aos 6 e 12 anos no primeiro ano de pós-operatório, seguidas de uma vez a cada ano. O tempo médio de seguimento foi de 37,8 meses.

Coloração imunohistoquímica

Para imunohistoquímica, os blocos de parafina foram cortados em série em aproximadamente 5 cortes de espessura μm em lâminas carregadas. Primeiramente, os cortes foram penetrados e secos durante a noite em uma autoclave (56 0C). Foram desparafinizados com xileno por 30 minutos, lavados com 99% de álcool por 15 minutos e depois com 96% de álcool e água destilada. O Histostain-Plus Bulk Kit (Zymed 2nd Generation, LAB-SA Detection System, 85-9043) foi utilizado neste estudo. Para a recuperação de antígenos, os cortes foram micro-ondas quatro vezes durante 5 minutos em tampão citrato (Ph 6.0). A atividade endógena da peroxidase foi bloqueada pela incubação dos cortes com 3% de H2O2 e lavada com água destilada e aguardada em PBS por 5 min. Para evitar reações não específicas, os cortes foram incubados com solução de bloqueio. Ki-67 com uma razão de diluição de 1:50 (Laboratórios Zymed, Mouse, Monoclonal, Clone 7B11) foi utilizado como anticorpo primário. As lâminas foram incubadas com Ki-67 durante 120 min. O anticorpo secundário foi reagido durante 25 min. AEC (Zymed Laboratories, 00-2007, Lote No:319293A) cromogénio foi utilizado para visualizar a reacção. Finalmente, os cortes foram contra-manchados com hematoxilina de Mayer, cobertos e avaliados por um microscópio de luz.

AgNOR corante

Para a coloração AgNOR, os blocos de parafina foram cortados em aproximadamente 5 seções espessas μm. Os cortes foram desparafinados com xileno por 30 minutos e lavados com 99% de álcool por 15 minutos, depois com 96% de álcool e água destilada. As lâminas foram imersas em uma solução de ácido cítrico/solução de etanol (1:3). A solução de nitrato de prata 50% foi misturada em solução de gelatina 2 g/dL dissolvida em ácido fórmico 1g/dL na proporção de 1:2 e os cortes foram incubados em sala escura por 30 min. Após a lavagem da água destilada, os cortes foram desidratados com etanol, limpos com xileno e cobertos e avaliados por microscópio de luz.

Métodos de avaliação

Ki-67 lâminas imunes foram examinadas com ampliação de 400x no microscópio Olympus BX60. No epitélio, as células positivas e negativas foram contadas em 5 campos microscópicos contíguos e consecutivos de alta potência. O número de células positivas foi dividido no número total de células contadas em toda a camada. O resultado foi multiplicado por 100 para encontrar a percentagem de células positivas. As lâminas manchadas com AgNOR foram examinadas com uma ampliação de 1000x com óleo de imersão no microscópio Olympus BX60. O número de AgNORs no núcleo foi contado em 250 células para cada caso. Os pontos negros/agregados dentro dos núcleos celulares foram contados como um ponto. O número médio de AgNORs foi dividido em número total de células.

Análise estatística

Análise estatística foi auxiliada pelo NCSS (Number Cruncher Statistical System) 2007 Statistical Software (Utah, EUA). O teste qui-quadrado e o teste exato de Fisher foram usados para avaliar parâmetros qualitativos. O teste Mann-Whitney-U foi usado para avaliar a estatística descritiva (mediana, intervalo interquartil) (SD) e diferenças entre os grupos. Probabilidades inferiores a 0,05 foram aceitas como significativas.

Resultados

As idades dos membros do grupo recorrente foram estatisticamente menores do que as dos membros do grupo não recorrente (p=0,035). Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada entre os grupos recorrentes e não recorrentes em relação ao acompanhamento. (p=0,472). Os valores Ki-67 do grupo recorrente foram encontrados estatisticamente superiores aos do grupo não recorrente. (p=0,045). Os valores de AgNOR do grupo recorrente foram estatisticamente maiores que os do grupo não recorrente (p=0,049) (Tabela 2).

Maior parte das células Ki- 67 sendo detectadas nas camadas suprabasais (Figura 1) Os pontos AgNOR eram mais altos no núcleo das células subrabasais do que as células basais no KCOT (Figura 2).

Não foi observada diferença estatisticamente significante entre os grupos recorrentes e não recorrentes quanto ao sexo (p=0,952).

Não foi observada diferença estatisticamente significante entre Kİ-67 e AgNOR quanto à faixa etária.

Foi encontrada correlação positiva estatisticamente significante entre os valores de Kİ-67 e AgNOR. (r=0,853 p=0,0001). (Tabela 3).

Discussão

Em nosso estudo, não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos recorrentes e não recorrentes em relação ao gênero; embora alguns autores considerem que o gênero poderia desempenhar um papel importante na taxa de recorrência (9,10). Outros consideram que o gênero não é um determinante significativo da recorrência (11,12,13).

As idades dos membros do grupo recorrente foram estatisticamente menores que as dos não recorrentes (p=0,035). Esta situação foi semelhante à encontrada por Forssell et al. e Gonzalez-Alva et al. que relataram uma maior taxa de recorrência em pacientes jovens (14,15). Essa situação pode estar associada ao fato de que pacientes mais jovens frequentemente recebem uma abordagem mais conservadora, como a preservação dos dentes associados, conforme apresentado em nosso estudo.

A abordagem conservadora e agressiva tem sido relatada sobre o manejo do KCOT. A escolha do tratamento deve levar em consideração a idade do paciente, tamanho da lesão, história prévia de recorrência, envolvimento de partes moles e características histológicas (16). No método conservador, sugere-se a enucleação simples com ou sem curetagem, marsupialização e descompressão. Os métodos agressivos incluem: ostectomia periférica, curetagem química com solução de Carnoy e ressecção periost, de tecidos ou radicais ósseos (17, 18). O tratamento dos KCOTs ainda é controverso. Uma recente revisão da Cochrane demonstrou que existe a necessidade de estudos clínicos controlados e bem conduzidos sobre o tratamento dos KCOTs (19).

As taxas de recorrência dos KCOTs relatados tendem a variar de 0% a 100% (2, 18, 20, 21). Acredita-se que estas discrepâncias marcantes estejam relacionadas com os diferentes períodos de seguimento pós-operatório, técnicas operatórias empregadas ou inclusão de casos com síndrome do carcinoma nevóide basocelular (NBCCS). Os tumores também variam em sua agressividade, contribuindo para a variação dos padrões de recidiva (18). A taxa de recidiva é maior com a enucleação simples (sem curetagem) e varia de 9% a 62,5% (22). A ressecção oferece uma alta taxa de cura, mas produz uma morbidade significativa, como a perda da continuidade mandibular ou desfiguração facial. Portanto, deve ser reservada apenas para lesões agressivas ou recorrentes, ou para pacientes que não podem ser acompanhados de perto após tratamentos conservadores (22). Em nosso estudo, todos os casos foram tratados com enucleação com curetagem, conforme relatado por Boffano et al (23). Uma rebarba cirúrgica foi utilizada para remover cerca de 2mm de osso cortical ao redor do osso remanescente após a enucleação. Apenas em 2 casos foi realizada descompressão antes da enucleação com curetagem. A taxa de recidiva foi de 13,6%; semelhante aos relatos que mostraram a enucleação e curetagem como tratamento do KCOT, como apresentado em nosso estudo (18,23). Por outro lado, a taxa de recidiva em nosso estudo foi considerada bastante baixa em relação aos relatos anteriores que demonstraram o método da enucleação simples como tratamento do KCOT (24,25,26,27).

Os pacientes ainda estão sob observação periódica em nossa instituição. Por outro lado, tem sido relatado que o KCOT pode voltar mesmo após 6 a 25 anos após a enucleação (25). Portanto, não é possível tirar conclusões a longo prazo sobre as taxas de recidiva em relação ao tempo médio de seguimento (37,8 meses) do presente estudo.

Foi relatado que os KCOTs localizados na região molar mandibular apresentaram taxas de recidiva significativamente mais elevadas do que os encontrados em outros locais. Acredita-se que a dificuldade em remover todos os traços do revestimento epitelial seja um fator importante que leva à recorrência (17). Em nosso estudo, apenas uma das lesões recorrentes foi observada na mandíbula (no 7, na tabela 1). O tamanho da lesão era superior a 5 cm e localizada na parte posterior da mandíbula, elevando-se até o processo condilar. Após 8 meses da descompressão, o tumor foi enucleado com curetagem. 11 meses após a enucleação, a lesão recidivou e foi tratada novamente dentro da mesma abordagem conservadora. A recidiva foi associada ao difícil acesso cirúrgico, ao grande tamanho e também ao comportamento biológico agressivo da própria lesão, que foi demonstrado com o maior índice de Ki67 label e contagem de AgNORs. Não foi possível remover o tumor em uma só peça. As outras duas lesões recidivantes foram observadas na maxila. O tamanho das lesões era superior a 4 cm e as lesões foram removidas em uma única peça. Os tamanhos dos tumores não recorrentes variam de 1 a 5 cm. A recidiva pode ser explicada com o tratamento conservador (ressecção radicular) dos dentes associados. A extracção dos dentes foi mantida a um nível mínimo. Os pacientes negaram múltiplas extrações dentárias e aceitaram o risco de recidiva. Portanto, acredita-se que alguns remanescentes tumorais que estavam associados aos dentes possam causar a recorrência, como relatado Pogrel (28).

KCOTs surgem de células epiteliais odontogênicas e remanescentes da lâmina dentária, e também de extensões de células basais do epitélio bucal. As células epiteliais dos KCOTs parecem ter um potencial proliferativo diferente de outras lesões odontogênicas (4).

Ki-67 anticorpos são úteis para estabelecer a fração de crescimento celular em neoplasias. A expressão do Ki-67 mostrou-se maior no epitélio dos KCOTs quando comparado aos cistos de desenvolvimento e inflamatórios, com a maioria das células de Ki- 67 sendo detectadas nas camadas suprabasais, como relatado em nosso estudo (2, 3, 29).

Números limitados dos estudos foram publicados sobre a avaliação dos AgNORs em cistos e tumores odontogênicos. Resultados conflitantes foram observados nestes estudos (6, 30, 31, 32, 33, 34). Coleman et al. investigaram se os AgNORs podem ser úteis na distinção de vários quistos odontogênicos do ameloblastoma unicístico. Concluíram que a contagem de AgNORs não tem significado diagnóstico e não pode ser usada para distinguir os vários cistos odontogênicos uns dos outros nem do ameloblastoma unicístico (30). Allison e Spencer realizaram a contagem de AgNOR com quistos apicais periodontais, quistos dentígrados, queratocistos odontogênicos, ameloblastomas e carcinomas basocelulares. Eles relataram diferenças significativas entre o KCOT e o cisto periodontal apical. Nesse estudo, a média de AgNOR para todos os cistos odontogênicos variou entre 2,02 e 2,65, e para os ameloblastomas foi de 2,24. De acordo com os resultados, concluíram que o método não tinha valor diagnóstico nem prognóstico nessas lesões (34). Em nosso estudo, os pontos AgNOR foram maiores no núcleo de células subrabasais do que as células basais no KCOT. Os valores médios dos AgNORs foram encontrados maiores em relação à faixa de contagem relatada na literatura (6, 32, 34).

As diferenças na literatura podem estar associadas às diferenças no método de coloração e protocolo de contagem para o AgNOR e devido à diferença no tamanho simples. Portanto, estamos de acordo com Gadbail et al e Eslami et al que recomendaram um protocolo padrão para o protocolo de coloração e contagem de AgNOR (6, 32).

Existem vários fatores de confusão para a análise da relação entre recorrência de KCOT e variáveis clinicopatológicas e imunohistoquímicas. Não há dúvida de que o manejo cirúrgico é o fator mais influente para as recidivas após qualquer intervenção cirúrgica. Entretanto, não foi estudado, para um grupo submetido a um único procedimento cirúrgico de KCOT, reduzir a influência de fatores de confusão. Além disso, pouco se sabe sobre qualquer relação entre a expressão de marcadores proliferativos celulares e a recorrência no KCOT em termos de riscos recorrentes para variáveis dependentes do tempo (18). Os resultados de nosso estudo demonstraram maior expressão da contagem de Ki-67 e AgNOR nas lesões recorrentes em comparação à lesão não recorrente. Por outro lado, Li et al, relataram que não houve diferença significativa entre lesões simples (não recorrentes) e recorrentes em relação à expressão da expressão de Ki-67 (35).

A limitação deste estudo é que apenas dois marcadores foram avaliados. Por outro lado, o ponto importante deste estudo é a demonstração da correlação positiva entre Ki-67 e AgNORs nas camadas de células suprabasais de KCOTs. Esta correlação positiva significativa também foi relatada por Gadbail et al (6).

Outra limitação é o baixo tamanho da amostra das lesões recorrentes. Em nosso estudo, a recorrência esteve presente apenas em 3 dos 22 indivíduos. Da mesma forma, Kuroyanagi et al, (18) relataram 4 lesões recorrentes entre 32 sujeitos diagnosticados com KCOT. Eles relataram que Ki-67 foi encontrado mais alto no grupo de recidivas e sugeriram que este marcador pode ser recomendado como um fator prognóstico. Nossos resultados consistem com Kuroyanagi et al. (18) a respeito da expressão de Ki-67. Adicionalmente, de acordo com nossos resultados, recomendamos que AgNOR pode ser útil como um marcador prognóstico em KCOTS.

Conclusion

Ki-67 e AgNOR pode ser útil como um marcador prognóstico em KCOTs. Um protocolo padrão necessário para a avaliação dos AgNORs. A correlação positiva destes marcadores reforçou o carácter neoplásico do KCOT. A maior expressão destes marcadores nas lesões recorrentes é importante para considerar intervenções cirúrgicas adicionais para melhorar o prognóstico.

Avalores

Os autores agradecem ao “ARK Biostatistical Office” pelas análises estatísticas do presente estudo.

Interesses Concorrentes

Os autores declararam que não há interesse concorrente.

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