O objectivo geral deste ensaio de inibição da hemaglutinação é medir os títulos de anticorpos contra vírus específicos de interesse. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da vacinologia sobre a imunidade e protecção mediada por vacinas dentro de diferentes populações e em vários grupos etários e de doentes. As principais vantagens desta técnica são que ela é precisa e permite a rápida determinação do título da presença de anticorpos neutralizantes.
Embora este método possa fornecer uma visão dos títulos de anticorpos humanos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como títulos de anticorpos para soro de camundongo, também sobrenadantes de cultura. Comece etiquetando 96 placas de microtitulação de poço com a informação experimental apropriada. Depois rode a placa na orientação vertical e use uma pipeta multicanal para adicionar 25 microlitros de PBS a cada poço, excepto ao primeiro poço da linha de titulação posterior inferior.
Adicionar 50 microlitros da solução antigénica recentemente preparada de interesse ao primeiro poço da linha de titulação posterior, seguido da adição de 25 microlitros de amostras de soro tratado com RDE aos primeiros poços das dez linhas superiores. Adicionar 25 microlitros do anti-soro apropriado ao primeiro poço da 11ª fila, como controle positivo. A transferência de 25 microlitros do primeiro poço de cada fila para os seus poços sucessivos para realizar diluições em série, em duas vezes.
Pipetas para cima e para baixo 10 a 15 vezes para cada etapa de diluição, descartando os 25 microlitros finais dos últimos poços. Em seguida, adicionar 25 microlitros da solução antigênica a cada poço das linhas de um a 11 e 25 microlitros de PBS somente a cada poço da linha de titulação posterior. Bata a placa cuidadosamente 10 vezes nos quatro lados para misturar.
Depois cubra a placa durante 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, adicionar 50 microlitros de solução de eritrócitos a cada poço e misturar a placa com mais batimento. Em seguida, cobrir novamente a placa e incubar os eritrócitos de acordo com as espécies utilizadas, conforme indicado na tabela.
Após adicionar os eritrócitos à placa, aderir ao tempo de incubação adequado para o tipo de sangue utilizado no ensaio. Uma incubação demasiado curta ou demasiado longa conduzirá a uma interpretação incorrecta dos resultados. No final da incubação, avaliar a hemaglutinação inclinando a placa 90 graus durante 25 segundos e marcar os resultados para cada poço, enquanto a placa ainda está inclinada, num esquema impresso da placa do poço 96.
Neste experimento, a resposta de anticorpos induzidos pela vacina foi avaliada em 26 voluntários saudáveis que receberam uma vacina inativada e trivalente contra influenza contendo influenza A/H1N1/Califórnia/2009, A/H3N2/Texas/2012 e B/Massachusetts/O2/2012 antes da temporada de influenza de 24 de 2015. Foi observada uma resposta imunológica reativa cruzada para as cepas do vírus A/H3N2/Suíça/2013 e A/H3N2/Texas/2012, com títulos de inibição da hemaglutinação média geométrica significativamente mais baixos e seroproteção induzida contra a gripe A/H3N2/Suíça/2013 em comparação com a gripe A/H3N2/Texas/2012. Após a vacinação, os títulos de anticorpos contra ambas as cepas aumentaram, embora a cepa A/H3N2/Suíça/2013 não estivesse presente na vacina.
A hemaglutinina viral demonstra um potencial dependente da espécie para a hemaglutinação eritrocitária. De interesse, o sangue de cobaia não hemaglutina adequadamente com influenza B e o sangue de peru tem o potencial de hemaglutinação com títulos altos e uma baixa reatividade cruzada. Uma vez dominada, esta técnica pode ser completada nas três horas se for realizada adequadamente.
Embora tente este procedimento, é importante lembrar de usar soro com EDR para inativar qualquer inibidor inespecífico e ligação inespecífica durante a hemaglutinação do vírus. Seguindo este procedimento, outros métodos como o ELISA podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o papel das imunoglobulinas específicas de cada patógeno. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu o caminho para que pesquisadores na área de imunologia viral pudessem aprofundar nosso entendimento da imunidade relacionada à vacina em pacientes saudáveis e imunossuprimidos em diferentes faixas etárias.
Após assistir este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar um ensaio de inibição da hemaglutinação para quantificar os títulos de anticorpos específicos da cepa da influenza em larga escala. Não se esqueça que trabalhar com antígenos virais, sangue animal e amostras de soro humano pode ser extremamente perigoso e que precauções como trabalhar em um laboratório BSL2 devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.