Biofísico Adam Cohen estava passeando por São Francisco, Califórnia, em 2010, quando um telefonema o pegou de surpresa. “Temos um sinal”, disse o telefonista. A quase 5.000 quilómetros de distância, em Cambridge, Massachusetts, os seus colaboradores tinham conseguido ouro. Após meses de experiências fracassadas, os investigadores tinham encontrado uma proteína fluorescente que lhes permitia observar sinais enquanto passavam entre neurónios.
Mas havia algo de estranho a acontecer. Quando Cohen voltou ao seu laboratório na Universidade de Harvard, ele soube que todas as gravações do experimento mostraram uma estranha progressão. No início, os neurónios decorados com a proteína brilhavam bem como os impulsos eléctricos que os atravessavam. Mas depois as células transformaram-se em bolhas brilhantes. “A meio de cada gravação, o sinal ficava selvagem”, diz Cohen.
Então ele decidiu juntar-se à sua equipa durante uma experiência. “Quando começavam a gravação, eles sentavam-se ali a suster a respiração”, diz Cohen. Mas assim que percebessem que estava funcionando, eles comemorariam, “dançando e correndo pela sala”.
Na sua exuberância, eles deixavam a luz de um candeeiro de mesa brilhar diretamente no microscópio. “Estávamos realmente registrando nossa excitação”, diz Daniel Hochbaum, então um estudante de pós-graduação do grupo de Cohen. Eles diminuíram suas celebrações e, um ano depois, a equipe publicou seu estudo1 – um dos primeiros a mostrar que uma proteína fluorescente projetada em neurônios específicos de mamíferos poderia ser usada para rastrear impulsos elétricos individuais em tempo real.
Neuroscientistas tentam há décadas observar os sinais elétricos rápidos que são um componente importante da linguagem do cérebro. Embora os eléctrodos, o cavalo de batalha para medir a tensão, possam registar de forma fiável a actividade de neurónios individuais, eles lutam para capturar os sinais de muitos, particularmente por períodos prolongados. Mas nas últimas duas décadas, os cientistas encontraram uma maneira de incorporar proteínas fluorescentes, indicadoras de tensão, diretamente nas membranas celulares dos neurônios. Com o tipo certo de microscópio, eles podem então ver as células se iluminando enquanto falam umas com as outras – seja em um sussurro ou em um grito. A imagem de voltagem também pode registrar a conversa elétrica entre muitos neurônios ao mesmo tempo, e então fazer uma média desses sinais através de grandes pedaços de tecido cerebral. Isso ajuda os pesquisadores a estudar a atividade elétrica do cérebro através de diferentes escalas espaciais, ouvindo não apenas as vozes das células individuais, mas também “o rugido da multidão”, diz Cohen.
Nos últimos 5 anos, os cientistas publicaram cerca de 1.000 artigos sobre o tema, e grandes esquemas de financiamento como a iniciativa BRAIN do US National Institutes of Health aceleraram o desenvolvimento de novos tipos de indicadores de voltagem geneticamente modificados. Na esperança de encontrar melhores variantes, alguns grupos criaram estratégias para rastrear milhões de proteínas para as características desejadas, como o brilho. Uma dessas abordagens identificou um indicador que é duas vezes mais brilhante que sensores similares desenvolvidos apenas quatro anos antes2,
As proteínas melhoram, e os avanços na microscopia tornam mais fácil vê-las, os cientistas esperam iluminar o maior quebra-cabeça da neurociência: como as células do cérebro trabalham juntas para transformar um sistema de pulsos elétricos em pensamentos, ações e emoções. Os pesquisadores ainda estão lutando para capturar toda a gama de atividades e para conceber maneiras de ver os nervos disparando rápido e profundamente dentro do tecido cerebral. Mas se os avanços podem resolver esses desafios técnicos, “seria revolucionário”, diz Rafael Yuste, que estuda a função dos circuitos neurais na Universidade de Columbia em Nova York.
Processo de alta velocidade
O cérebro humano médio contém cerca de 120 bilhões de neurônios, que constantemente recebem e enviam informações através de apêndices tipo ramo chamados dendritos. Sinais químicos ou elétricos que atingem os dendritos produzem pequenas mudanças de voltagem através da membrana da célula, que são encaminhados para o corpo da célula. Quando a soma das mudanças de voltagem atinge um ponto sem retorno, chamado limiar, o neurônio dispara um grande pico elétrico – um potencial de ação. Esta sacudidela atinge velocidades de até 150 metros por segundo ao longo de um ramo neuronal, conhecido como um axônio, para outro conjunto de apêndices de ramificação. Aqui, sinais químicos ou elétricos passam a informação para o próximo conjunto de dendritos.
Sinais neuronais convergem, divergem e se sincronizam para produzir uma sinfonia de pensamentos, emoções, ações e reações, desde o rubor de um rosto até o soluço de um bebê. Mas as ferramentas de escuta dos cientistas são extremamente limitadas. Desenvolvidos pela primeira vez nos anos 40, eletrodos miniatura tão finos quanto um cabelo podem ser inseridos no cérebro, contra ou dentro de neurônios, onde medem a voltagem da membrana com precisão e velocidade. Mas esta abordagem pode ser usada para monitorar apenas um ou um punhado de neurônios ao mesmo tempo – e apenas por um tempo limitado, porque os eletrodos eventualmente danificam a célula. É como tentar obter a essência de um arranjo orquestral, seguindo um músico por alguns segundos.
Bundles de microeletrodos podem registrar a atividade elétrica de até 200 células de uma vez, mas como estes eletrodos são colocados perto dos neurônios ao invés de dentro deles, eles podem detectar apenas os potenciais de ação, os picos mais afiados na atividade elétrica. Eles são surdos a notas mais suaves – as pequenas mudanças elétricas que não empurram o neurônio até um potencial de ação. Essas mudanças de voltagem de sub-limiar são a chave para a função cerebral, porque elas gradualmente se somam para determinar se um neurônio irá ou não disparar.
Na esperança de medir uma atividade cerebral mais silenciosa em populações maiores de células, os cientistas nos anos 60 começaram a brincar com a idéia de um sensor ou sonda que fluoresce em resposta a um sinal elétrico. As sondas mais populares, chamadas indicadores de cálcio, acendem quando se ligam ao cálcio, que flui para o neurônio como resultado de um pico na atividade elétrica. Mas a técnica, conhecida como imagem de cálcio, fornece apenas um proxy; ela não registra diretamente a voltagem da membrana. E embora mostre o sinal de grandes eventos, como potenciais de ação, ela perde coisas que são cruciais para a função cerebral, como oscilações sutis na voltagem da membrana ou os sinais elétricos que inibem os potenciais de ação. Imagine ser capaz de ouvir apenas uma explosão de aplausos após um concerto sinfônico: é claro que a orquestra já se apresentou, mas o que ela estava tocando é um palpite de qualquer um.
Nos anos 70, os cientistas começaram a desenvolver sensores de corantes que detectam diretamente as mudanças na voltagem da membrana. As primeiras versões destes corantes tinham que ser pintadas no cérebro indiscriminadamente, então eles etiquetavam todos os tipos de células, incluindo células não neuronais, dificultando a análise da atividade de neurônios específicos.
Então, nos anos 90, pesquisadores começaram a testar indicadores que poderiam ser geneticamente modificados para aparecer apenas em neurônios de interesse. O primeiro3 indicador de tensão codificado geneticamente (GEVI) foi desenvolvido em 1997; desde então, os cientistas já projetaram mais de duas dúzias de sensores4. Alguns deles são feitos pela combinação de uma proteína sensível à tensão com moléculas fluorescentes (ver “Os sabores da fluorescência”). Quando estas proteínas detectam uma mudança na voltagem, alteram a sua estrutura 3D e alteram a fluorescência da molécula a que estão acopladas. Outros indicadores de voltagem são versões mutantes de rodopsinas microbianas, moléculas fluorescentes que causam uma mudança de voltagem através da membrana plasmática em resposta à luz. Estas proteínas também podem funcionar de forma inversa, alterando a sua resposta à luz – e portanto a sua fluorescência – em resposta a uma alteração da tensão da membrana.
Tudo no detalhe
Até agora, os GEVIs provaram ter sucesso no rastreamento de potenciais de ação individual tanto em neurônios cultivados, cultivados em um prato, quanto no cérebro intacto de uma ampla gama de animais, de insetos5 a camundongos6. Uma das maiores promessas da técnica é seu potencial para registrar não apenas os grandes eventos, mas também as pequenas mudanças na tensão da membrana que refletem as mensagens que um neurônio recebe das células vizinhas, diz Cohen. “A imagem de voltagem permite ver as entradas para os neurônios in vivo, que não tínhamos como olhar anteriormente”, diz ele.
No ano passado, Cohen e seus colegas desenvolveram novos GEVIs e melhoraram as técnicas de microscopia para registrar tais mudanças de voltagem de sub-limiar de muitos neurônios ao mesmo tempo, inclusive no cérebro do mouse7,8. A equipe também foi capaz de registrar a atividade elétrica dos mesmos neurônios até uma semana depois. A capacidade de saber exatamente quais neurônios estão sendo registrados e de acompanhá-los ao longo do tempo permite que os pesquisadores observem a fiação entre esses neurônios, diz Ed Boyden, um neurocientista do Instituto de Tecnologia de Massachusetts em Cambridge. Ao fazer isso, “você pode ligar a estrutura do cérebro com sua função”, diz ele. “Essa é uma das questões centrais em toda neurociência”
Outra vantagem dos GEVIs é que, ao contrário dos eletrodos, que registram principalmente sinais do corpo celular, eles podem registrar sinais elétricos de qualquer parte de uma célula nervosa, até as pontas dos dendritos (veja ‘Acertando as escalas’). Isso é como poder ouvir especificamente as notas tocadas pela mão esquerda de um pianista. “Isto é algo com que tenho sonhado há muito tempo – e não estou sozinha”, diz Katalin Toth, uma neurobióloga da Universidade Laval na cidade de Quebec, Canadá. Muitos neurocientistas estão se esforçando para seguir a voltagem em neurônios inteiros para ver como ela muda em diferentes regiões da célula, ela diz.
Wei Wei, uma neurobióloga da Universidade de Chicago, Illinois, está usando GEVIs para descobrir como diferentes entradas elétricas são integradas nos neurônios da retina do mouse. Wei está interessado em uma classe de neurônios que responde mais fortemente a um estímulo visual quando está se movendo em uma determinada direção. Ao observar como a tensão da membrana muda em diferentes partes desses neurônios, ela espera entender como as células somam os sinais de entrada para detectar a direção do movimento.
Neurofisiologista Vincent Villette da Ecole Normale Supérieure em Paris planeja usar sensores de tensão para estudar como as flutuações regulares dos sinais elétricos de sub-limiar determinam como os neurônios no cerebelo do camundongo coordenam a atividade muscular. “Há muito a ser entendido sobre como as células agem juntas”, diz Villette.
A obtenção de uma leitura visual da voltagem da membrana também permite aos cientistas ver sinais elétricos que inibem o disparo neuronal em vez de acioná-lo. Como os sinais inibidores são impossíveis de registrar com abordagens como a imagem do cálcio, não está claro como exatamente eles moldam a atividade cerebral, diz Rosa Cossart, uma neurobióloga do Instituto Mediterrânico de Neurobiologia, em Marselha, França.
Cossart tem usado eletrodos e imagens de cálcio há anos, mas agora ela está ansiosa para experimentar GEVIs. Ela espera que estes sensores lhe permitam medir a tensão em alta velocidade em vários neurônios – pelo menos 50 – ao mesmo tempo em um mouse vivo. Isso ajudaria a entender como grupos de neurônios integram sinais elétricos – tanto excitatórios quanto inibitórios – para apoiar atividades que são cruciais para o desenvolvimento e funcionamento do cérebro, diz ela.
Desafios de profundidade
Embora as altas expectativas, conseguir GEVIs para trabalhar no laboratório pode ser um incômodo. Veja Helen Yang: como estudante de pós-graduação na Universidade de Stanford na Califórnia, ela decidiu experimentar GEVIs como uma forma de estudar os neurônios no sistema visual da mosca da fruta. Mas olhando através do microscópio durante sua primeira experiência, Yang não viu nenhuma alteração na fluorescência das células, nem mesmo quando ela lançou uma luz brilhante nos olhos das moscas. Só quando ela analisou os dados é que percebeu que os estímulos visuais estavam produzindo um sinal, era apenas um pequeno sinal. “Eu estava bastante animada, mas meus colegas de laboratório estavam menos”, diz ela. “As respostas eram bem pequenas e barulhentas.”
Yang começou a brincar com as configurações do microscópio, aumentando a potência do laser e acelerando a imagem. “Basicamente fiz com que fosse o mais rápido que o nosso microscópio podia”, diz ela. Isso porque a resposta do indicador a um sinal elétrico foi tão rápida que a mudança na fluorescência foi detectável apenas por uma fração de segundo. “Se você está capturando apenas um quadro durante o tempo que a célula está respondendo, a resposta não parece nada grande”, diz Yang.
Yang eventualmente conseguiu usar GEVIs para investigar como os neurônios das moscas processam os sinais visuais5 , mas os tipos de desafios que ela enfrentou até agora impediram que a imagem de voltagem se tornasse uma técnica comum. Ela requer plataformas de microscópio avançadas, muitas vezes construídas sob medida, diz Cohen. “Não podes fazer isto no microscópio fluorescente da tua avó.”
Nos últimos cinco anos, o apoio financeiro da iniciativa BRAIN impulsionou os avanços no campo, incluindo o desenvolvimento de melhores GEVIs, diz Michael Lin, um engenheiro de proteínas em Stanford.
Em paralelo com o desenvolvimento de novos sensores, os cientistas estão trabalhando em técnicas de imagem com precisão os rápidos sinais elétricos que viajam através do cérebro. Um desafio é que a maioria das técnicas disponíveis só funcionam bem com células em um prato ou na superfície do cérebro. Mas o cérebro dos mamíferos não é transparente: na verdade, parece tofu, diz Na Ji, um físico da Universidade da Califórnia, Berkeley.
Para aprofundar, os investigadores têm de recorrer a métodos mais invasivos, tais como remover algum do tecido sobrejacente ou colar pequenos dispositivos ópticos chamados micro endoscópios directamente no cérebro. Uma forma alternativa, não invasiva, de olhar para tecidos opacos – até 1 milímetro de profundidade – é a microscopia de dois fótons. Esta técnica utiliza luz de maior comprimento de onda, de menor consumo energético, que pode penetrar mais profundamente nos tecidos. Como os microscópios de dois fotões iluminam-se e gravam de um único ponto de cada vez, captam imagens demasiado lentamente para acompanhar a maior parte da conversa rápida do cérebro. Mas os especialistas estão confiantes de que os avanços na tecnologia em breve tornarão possível ver os sinais produzidos pelos GEVIs a uma velocidade superior. “É absolutamente possível”, diz Ji.
Se as diferentes abordagens podem superar estes desafios, os cientistas não têm dúvidas de que a imagem de voltagem se tornará uma abordagem padrão para medir a atividade cerebral. “No próximo ano ou dois, veremos muitos trabalhos que aplicaram sensores de voltagem e aprenderam sobre biologia”, diz Thomas Clandinin, um neurobiólogo de Stanford. Alguns dizem que a técnica pode até substituir os eléctrodos para questões relacionadas com a forma como os neurónios processam e integram a informação.
Os investigadores de carreira são particularmente optimistas: Hochbaum, que é agora um pós-doutorado na Harvard Medical School em Boston, diz que a longo prazo, os GEVIs serão uma ferramenta para estudar como os diferentes compartimentos na célula respondem aos sinais de sub-limiar. Ele planeja usar imagens de tensão para entender como tais sinais alteram a conexão entre os neurônios, um processo chave na aprendizagem. As possibilidades são excitantes, diz Hochbaum, mas ele aprendeu pelo menos uma lição importante daqueles primeiros dias de saltar pelo laboratório na alegria depois de ver um brilho em um microscópio: quando os experimentos funcionarem, mantenha as celebrações a um mínimo.