Enzimas chave e componentesEditar
O processo de recombinação V(D)J é mediado pela recombinação VDJ, que é uma coleção diversa de enzimas. As principais enzimas envolvidas são a recombinação ativando os genes 1 e 2 (RAG), a deoxinucleotidil transferase terminal (TdT), e a nuclease Artemis, um membro da via de união final ubíqua não homóloga (NHEJ) para a reparação do DNA. Sabe-se que várias outras enzimas estão envolvidas no processo e incluem a proteína quinase dependente do DNA (DNA-PK), a proteína 4 (XRCC4), a ligase IV do DNA, o fator de união final não-homólogo 1 (NHEJ1; também conhecido como Cernunnos ou fator do tipo XRCC4), o Paralog de XRCC4 e XLF (PAXX), recentemente descoberto, e as polimerases de DNA λ e μ. Algumas enzimas envolvidas são específicas para linfócitos (por exemplo, RAG, TdT), enquanto outras são encontradas em outros tipos de células e mesmo ubíquamente (por exemplo, componentes NHEJ).
Para manter a especificidade da recombinação, a recombinase V(D)J reconhece e liga a seqüências de sinais de recombinação (RSSs) flanqueando a variável (V), diversidade (D), e juntando segmentos de genes (J). As RSSs são compostas de três elementos: um heptamer de sete nucleotídeos conservados, uma região espaçadora de 12 ou 23 pêlos-base de comprimento e um nonamer de nove nucleotídeos conservados. Enquanto a maioria das RSSs varia em sequência, as sequências de heptamer e não-amer consensuais são CACAGTG e ACAAAACC, respectivamente; e embora a sequência da região espaçadora seja mal conservada, o comprimento é altamente conservado. O comprimento da região espaçadora corresponde aproximadamente a uma (12 pêlos-base) ou duas voltas (23 pêlos-base) da hélice de DNA. Seguindo o que é conhecido como Regra 12/23, segmentos gênicos a serem recombinados são normalmente adjacentes a RSSs de diferentes comprimentos de espaçadores (ou seja, um tem um “12RSS” e o outro um “23RSS”). Esta é uma característica importante na regulação da recombinação V(D)J.
ProcessEdit
V(D)J recombinação começa quando V(D)J recombinase (através da atividade de RAG1) liga um RSS flanqueando um segmento de gene codificador (V, D, ou J) e cria um único nick no DNA entre a primeira base do RSS (pouco antes do heptamer) e o segmento codificador. Isto é essencialmente energeticamente neutro (sem necessidade de hidrólise ATP) e resulta na formação de um grupo livre de 3′ de hidroxila e um grupo de fosfato de 5′ na mesma linha. O grupo hidroxila reativo é posicionado pela recombinase para atacar a ligação fosfodiéster de fios opostos, formando duas pontas de DNA: um grampo de cabelo (stem-loop) no segmento de codificação e uma ponta romba no segmento de sinal. O modelo atual é que o nicking de DNA e a formação do fio de cabelo ocorrem simultaneamente (ou quase) em ambas as vertentes num complexo conhecido como centro de recombinação.
As pontas de sinal rombo são ligadas entre si para formar uma peça circular de DNA contendo todas as sequências intervenientes entre os segmentos codificadores conhecidos como uma articulação de sinal (embora de natureza circular, isto não deve ser confundido com um plasmídeo). Embora originalmente se pense que se perca durante divisões celulares sucessivas, há evidências de que as articulações de sinal podem reentrar no genoma e levar a patologias ativando oncogenes ou interrompendo a função do gene supressor do tumor.
As extremidades codificadoras são processadas antes da sua ligadura por vários eventos que, em última instância, levam à diversidade juncional. O processamento começa quando o DNA-PK se liga a cada extremidade de DNA quebrado e recruta várias outras proteínas incluindo Artemis, XRCC4, DNA ligase IV, Cernunnos, e várias polimerases de DNA. O DNA-PK forma um complexo que leva à sua auto-fosforilação, resultando na ativação da Artemis. Os grampos capilares da extremidade codificadora são abertos pela atividade da Artemis. Se forem abertos no centro, resultará numa extremidade romba do ADN; no entanto, em muitos casos, a abertura é “off-center” e resulta em bases extra que permanecem sobre um fio (uma saliência). Estes são conhecidos como nucleotídeos palindrómicos (P) devido à natureza palindrómica da sequência produzida quando as enzimas de reparação do ADN resolvem a saliência. O processo de abertura do fio de cabelo pela Artemis é uma etapa crucial da recombinação V(D)J e é defeituoso no modelo de imunodeficiência combinada grave (scid) do rato.
Next, XRCC4, Cernunnos, e DNA-PK alinham as pontas de DNA e recrutam a deoxinucleotidil transferase terminal (TdT), uma polimerase de DNA independente de modelo que adiciona nucleotídeos (N) não acoplados à ponta de codificação. A adição é na sua maioria aleatória, mas o TdT tem preferência pelos nucleotídeos G/C. Como em todas as polimerases de DNA conhecidas, o TdT adiciona nucleotídeos a uma cadeia numa direcção de 5′ a 3′.
Pois, as exonucleases podem remover bases das extremidades de codificação (incluindo quaisquer nucleotídeos P ou N que possam ter-se formado). As polimerases de ADN λ e μ inserem depois nucleótidos adicionais, conforme necessário, para tornar as duas extremidades compatíveis para a união. Este é um processo estocástico, pelo que qualquer combinação da adição de nucleótidos P e N e remoção exonucleolítica pode ocorrer (ou não ocorrer nenhuma). Finalmente, as pontas de codificação processadas são ligadas entre si pela ligase de DNA IV.
Todos estes eventos de processamento resultam num paratope altamente variável, mesmo quando os mesmos segmentos genéticos são recombinados. A recombinação V(D)J permite a geração de imunoglobulinas e receptores de células T para antígenos que nem o organismo nem seus ancestrais precisam ter encontrado previamente, permitindo uma resposta imune adaptável a novos patógenos que se desenvolvem ou àqueles que mudam freqüentemente (por exemplo, influenza sazonal). No entanto, uma grande ressalva para este processo é que a seqüência de DNA deve permanecer na estrutura para manter a seqüência correta de aminoácidos no produto protéico final. Se a sequência resultante for fora da estrutura, o desenvolvimento da célula será preso, e a célula não sobreviverá até a maturidade. A recombinação V(D)J é, portanto, um processo muito caro que deve ser (e é) estritamente regulado e controlado.