Purificarea ADN monocatenar prin copolimerizare cu acrilamidă și electroforeză

ADN monocatenar (ssDNA) este util pentru aptameri (1), autoasamblare (2), origami ADN (3), circuite ADN (4), sonde de hibridizare (5) și robotică ADN (6). ADN-ul sintetizat chimic este implicit monocatenar.

În cele ce urmează, prezentăm o metodă de producere a ssDNA dintr-un produs PCR. Utilizarea unui produs PCR în locul ADN-ului sintetic poate fi avantajoasă, deoarece PCR introduce mai puține mutații decât sinteza chimică și poate genera ADN-uri mai lungi decât limita de ∼120 de baze pentru sinteza chimică. Pornind de la o probă clonală, produsele PCR pot avea, de asemenea, o puritate a secvenței semnificativ mai mare decât ADN-ul sintetizat chimic. O puritate ridicată a secvenței este esențială pentru performanțe ridicate în tehnologia circuitelor ADN (7).

Metoda noastră de generare a unui singur șir (SSG) este scalabilă și necesită o singură etapă de purificare. Aceasta elimină șirul complementar nedorit și realizează o purificare pe bază de mărime a amorselor reziduale și a produselor PCR nedorite. SSG prin copolimerizare și electroforeză poate fi aplicată produsului protocoalelor PCR avansate, cum ar fi asamblarea Gibson (8), pentru a crea produse lungi, monocatenare, cu o secvență arbitrară. Acest lucru poate fi util pentru ADN origami și alte aplicații de autoasamblare.

SSG profită de o modificare a ADN-ului disponibilă în comerț, cunoscută sub numele de acrilită. Această modificare adaugă o grupare de vinil polimerizabilă, care se încorporează într-un lanț polimeric de acrilamidă în creștere (9). ADN-ul modificat cu acrildit a fost utilizat pentru o serie de aplicații, inclusiv un hidrogel comutabil (10), captarea mercurului (11) sau a PDGF (12) și pentru modificarea vitezei de electroforeză a unor secvențe specifice (13). Tehnica noastră este superficial asemănătoare cu metoda prin care grupul Church a imobilizat colonii de polimerază în geluri subțiri de poliacrilamidă. Acridita este esențială pentru formarea de produse PCR clonale (polonii) în unele forme de secvențiere a ADN-ului (14).

În cazurile în care sunt necesare cantități semnificative de ADN ss pur, abordarea noastră care utilizează primeri modificați cu acrilită și imobilizarea cu poliacrilamidă este o opțiune utilă. De asemenea, arătăm că această tehnică poate integra SSG, separarea dimensională și electroeluția într-o singură etapă.

Materiale și metode

Dacă nu se specifică altfel, reactivii au fost achiziționați de la Sigma Aldrich (St. Louis, MO) și utilizați fără purificare suplimentară. ADN-ul a fost achiziționat de la IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) și a fost utilizat fără alte purificări (pentru informații privind secvențele, a se vedea tabelul suplimentar S1).

Demonstrarea captării filamentului de acrildit

Pentru demonstrarea inițială a SSG prin copolimerizare cu acrilamidă și apoi prin electroforeză, am modificat un primer cu acrildit și colorant fluorescent roșu Cy5. Celălalt primer a fost achiziționat cu o modificare fluorescentă verde 5′ fluoresceină. Figura 1 arată cum a fost pregătită proba de ADN prin amestecarea a 100 μl de gel denaturant 10% (prepolimer înainte de inițierea polimerizării) cu 100 μl de produs PCR (∼20 pMol de produs) și masa corespunzătoare de uree uscată (concentrație finală de acrilamidă 5%, concentrație finală de uree 7 M). ADN-ul/prepolimerul a fost încărcat într-un puț uscat al unui gel PAGE denaturant de 5%. Gelul a fost încălzit conform descrierii de mai jos, iar electroforeza a fost efectuată pentru a separa filamentul fluorescent verde de filamentul fluorescent roșu imobilizat. Gelul rezultat a fost imaginat cu ajutorul unui sistem standard de formare a imaginilor pe gel cu iluminare LED (FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA).

Generarea și purificarea monocatenarului (electroforeză pe gel vertical)

PCR a fost efectuată în toate cazurile cu kitul de reacție Accuprime Pfx (Life Technologies, Grand Island, NY) folosind 50 nM de șablon, 10 μM din fiecare primer și 8 cicluri termice. Produsul PCR a fost denaturat prin adăugarea de uree solidă la o concentrație finală de 7 M într-o reacție de 100 μl. Poliacrilamida a fost preparată dintr-o soluție stoc obținută în comerț de 40% acrilamidă în apă cu un raport 19:1 de acrilamidă:bis-acrilamidă (Bio-Rad, Hercules, CA). Poliacrilamida denaturantă a fost preparată cu concentrații finale de uree 7 M, acrilamidă 20% și tampon TBE 0,25×. Polimerizarea a fost inițiată prin adăugarea a 1 μl de TEMED (N,N,N,N′,N′-tetrametiletilendiamină) și a 10 μl de persulfat de amoniu 10% la o alicotă de 1 ml de prepolimer de acrilamidă denaturantă. O porțiune din acest amestec (prepolimer înainte de inițierea polimerizării) a fost rapid amestecată 1:1 cu 100 μl de produs PCR (cinci reacții PCR de 20 μl conform instrucțiunilor producătorului, grupate) cu uree 7 M (10% acrilamidă, concentrație finală). Amestecul de PCR/polimerizare cu acrilamidă a fost adăugat la un puț uscat într-un gel PAGE denaturant vertical standard. Polimerizarea completă a PCR/acrilamidei denaturante a fost asigurată prin spălarea spațiului de deasupra godeului cu un curent ușor de argon sau azot 99,97% (pentru a deplasa orice oxigen care inhibă polimerizarea). După ∼30 min de polimerizare, am montat instalația de electroforeză. Zdrobirea poliacrilamidei și încărcarea bucăților macerate în puț a produs o bandă foarte largă, de formă neregulată, astfel încât s-a renunțat la această abordare (datele nu sunt prezentate). Polimerizarea în interiorul godeului a fost o abordare superioară. Am încălzit tamponul de funcționare într-un cuptor cu microunde până la fierbere și am adăugat tamponul fierbinte (∼80°C-90°C) în rezervorul catodic (turnând tamponul fierbinte peste godeurile umplute) pentru a încuraja eliberarea ADN-ului din gode. Adăugarea tamponului fierbinte a fost continuată până când instalația de gel a fost plină până la volumul necesar pentru electroforeză. Gelul care conține ADN a fost în contact direct cu tamponul fierbinte în timp ce se aplica tensiunea. Tamponul fierbinte trebuie aplicat imediat ș i nu trebuie lăsat să se răcească. Am efectuat apoi electroforeza conform diagramei prezentate în figura 1.

BSB (5 mM borat de sodiu) și tampoanele TBE pot fi utilizate ca tampoane de funcționare. SB și TBE au fost preparate la RT la pH 8,42 și, respectiv, 8,36. La 80°C, aceste valori de pH se modifică la 8,21 și, respectiv, 7,47. Această modificare a pH-ului este tranzitorie. Gelul se răcește la 30°C-40°C în timpul electroforezei. Această modificare a pH-ului nu a cauzat o degradare notabilă a ADN-ului.

Pentru a vizualiza separarea celor două șiruri, am folosit amorse modificate cu doi fluorofori diferiți. Șirul mobil a fost generat folosind un primer modificat cu fluoresceină. Primerul (acrilat) pentru filamentul imobil a fost preparat cu o modificare internă Cy5. Folosind acești doi coloranți, am putut vizualiza progresul separării. Am scanat acest gel cu un gel imager (FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA) după 45 min de electroforeză la 500 V.

Ca o abordare alternativă, produsul PCR poate fi preconcentrat prin precipitare standard cu etanol. Peletul poate fi apoi dizolvat într-un volum mai mic de prepolimer de acrilamidă. În mâinile noastre, concentrația crescută din gode a fost compensată de pierderile din timpul precipitării. În unele cazuri (de exemplu, pentru o bandă de produs slabă), această abordare poate fi preferată.

Banda fluorescentă purtând produsul monocatenar modificat cu fluoresceină a fost tăiată de pe gel sub iluminare cu LED albastru la ∼475 nm (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). ADN-ul a fost eluat prin metoda standard de strivire și înmuiere (15). Atunci când ADN-ul eluat (recuperat) a fost prea diluat pentru o precipitare eficientă în etanol, l-am concentrat prin extracție cu butanol. Produsul a fost apoi precipitat cu etanol și analizat în continuare, așa cum se indică mai jos.

Analiză PAGE

Produsele monocatenare marcate cu fluoresceină (ssADN eliberat prin denaturare PAGE) au fost analizate pentru puritate utilizând PAGE nativ. Am resuspendat produsul monocatenar în 10 μl și l-am cuantificat prin spectroscopie UV-Vis. Am realizat concentrații molare egale de amorsă și de produs monocatenar și am electroforezat aceste probe și un ladder fluorescent verde de 25 pb (Jena Bioscience, Jena, Germania) pe un gel PAGE nativ de 15%, care a fost vizualizat cu ajutorul scanerului Storm pentru semnalul de fluoresceină.

Analiză quencher

Pentru a stabili în continuare că produsul era de fapt monocatenar, am testat hibridizarea unui oligonucleotid complementar (sondă quencher) care conține o modificare 3′ quencher. Atunci când este hibridizată în mod corespunzător, sonda de stingere poziționează un stingător negru Iowa la câțiva nanometri de modificarea de fluoresceină 5′ de pe șirul complementar. Acest lucru determină o scădere bruscă a intensității fluorescenței. Sonda de stingere se va hibridiza numai cu ssDNA. În cazul în care produsul este dublu catenar, atunci hibridizarea va fi blocată, iar fluorescența nu va fi afectată. S-au preparat eșantioane triplicate de 10 μl de produse modificate cu fluoresceină de 100 nM (produs PCR, produs SSG și control de amorsă) în tuburi PCR. Acestea au fost măsurate cu un fluorimetru QuantiFluor (Promega, Madison, WI) pentru valorile inițiale ale fluorescenței, iar apoi s-au adăugat echivalenți 1,1 molari de ADN de sondă de stingere, s-au amestecat în vortex, s-au centrifugat și s-au lăsat la incubat timp de aproximativ 1 minut. Fluorescența a fost apoi înregistrată pentru a determina dacă a avut loc vreo stingere.

Compararea tehnicilor de generare a unui singur șir pentru producerea de aptameri

Pentru a verifica eficacitatea acestei metode de generare de aptameri funcționali, am achiziționat un șablon pentru amplificarea PCR a unei secvențe cunoscute de aptameri care se leagă de lizozimă. Am amplificat acest șablon cu un primer modificat cu fluoresceină și un primer invers modificat cu acrilită. Am efectuat protocolul SSG așa cum s-a descris mai sus. Am conjugat lizozimul cu margele modificate cu carboxilat de 5,8 μm (Bangs Labs, Fishers, IN) prin protocolul standard de cuplare EDC. Aceste microsfere au fost incubate cu produsul SSG, ADN fluorescent randomizat (fără similaritate de secvență cu aptamerul) și un aptamer fluorescent sintetizat chimic cu aceeași secvență. Am incubat, de asemenea, margele neacoperite cu aptamerul fluorescent sintetizat chimic ca un control negativ. Incubațiile au fost efectuate timp de 30 de minute, iar bilele au fost apoi spălate de 3 ori. S-a efectuat citometrie în flux pe aceste particule cu un FACScalibur (BD Bioscience San Jose, CA). S-a înregistrat distribuția intensităților de fluorescență cu excitație cu lumină de 488 nm.

Generarea și purificarea monocatenarului (electroforeză pe gel orizontal)

Un gel de poliacrilamidă denaturantă cu uree 7 M a fost turnat orizontal, așa cum a fost descris anterior (16). Pe scurt, 25 ml de soluție de prepolimer (uree 7 M, 6 % acrilamidă/bis-acrilamidă, tampon SB) a fost inițiată cu 84 μl APS și 20 μl TEMED. Prepolimerul de gel a fost turnat într-o matriță orizontală. Matrița a fost apoi plasată într-un sac de plastic, care a fost purjat cu azot. Gelul a fost lăsat să se polimerizeze timp de 30 de minute. ADN-urile marcate cu fluoresceină și cele marcate cu acrilitină au fost amestecate în fosfat de sodiu 1 M la pH 8,0 și au fost recorectate prin creșterea temperaturii la 80°C și prin răcire lentă la 0,1°C pe secundă până la RT. Amestecul a fost răcit lent pentru a favoriza hibridizarea intermoleculară între două șiruri. Amestecul de prepolimer (2,5 ml) a fost inițiat prin adăugarea a 8,4 μl APS și 2 μl TEMED. După ce s-a amestecat, 20 μl din această soluție au fost adăugați la 5 μl de soluție de ADN. Aceasta a fost apoi transferată într-un puț uscat în gelul de poliacrilamidă. Pentru a se evita denaturarea liniilor de câmp electric, godeurile rămase au fost umplute cu acrilamidă care nu conține ADN. Gelul încărcat a fost plasat într-o pungă de plastic și purjat cu azot. Gelul a fost rulat la 10 V/cm timp de 10 minute. A fost apoi imaginat cu ajutorul unui transiluminator cu LED albastru și al unei camere digitale. Pentru a elibera ssADN-ul din gelul reticulat din gode, 25 ml de tampon SB au fost încălzite până la fierbere în cuptorul cu microunde. Acest tampon fierbinte a fost apoi turnat peste gel. S-a continuat electroforeza la 10 V/cm timp de 10 minute. Gelul a fost imaginat din nou așa cum a fost descris mai sus pentru comparație.

Asociația inițială dintre ADN-ul marcat cu fluoresceină și acrilat a fost promovată cu ajutorul unui tampon fosfat de sodiu 1 M. Dacă ADN-ul ar fi fost ținut împreună doar prin hibridizare, ureea 7 M și schimbarea tamponului în tampon SB 5 mM în timpul electroforezei ar fi fost adecvate pentru a elibera ADN-ul în gel. În schimb, a fost nevoie de căldură. Acest lucru a demonstrat că șuvița mobilă de ADN este asociată sau încurcată cu gelul mai degrabă decât cu șuvița sa complementară de ADN.

Rezultate și discuții

ADN-ul modificat cu acrilită este imobil sub electroforeză

Dintre cele două șuvițe ale produsului PCR dsADN, șuvița de acrilită este prinsă în copolimer, în timp ce șuvița complementară este mobilă. Pentru a demonstra acest lucru, s-a efectuat PCR cu un primer modificat atât cu acrilită, cât și cu un colorant fluorescent roșu (Cy5). Primerul invers a fost modificat cu fluoresceină. Produsul PCR a fost polimerizat într-un gel PAGE denaturant (5%). O diagramă schematică a procesului este prezentată în figura 1. Inițial, atât șirul fluorescent verde, cât și cel fluorescent roșu sunt co-localizate (gel de culoare galbenă). La aplicarea tensiunii, numai produsul marcat cu fluoresceină (verde) migrează în gel. Filamentul marcat în comun cu acrilitul și Cy5 (roșu) este fixat în imaginea finală a gelului (figura 1B). În plus, amorsa reziduală din reacția PCR este clar vizibilă ca o a doua bandă verde. După electroforeză, produsul pur, monocatenar, poate fi tăiat și eluat conform protocoalelor standard de purificare pe gel.

Verificare ADN monocatenar

Am izolat ADN monocatenar, modificat cu fluoresceină, prin tăierea și eluția benzii de interes. Pentru a demonstra că produsul recuperat prin această metodă este monocatenar, am folosit două metode diferite. Prima metodă a fost analiza gelului nativ. Figura 2A prezintă o imagine a unui gel nativ care conține amorsă, produsul PCR (dsDNA) și ssDNA purificat prin această metodă. Gelul nativ arată o separare clară între dsDNA și ssDNA. După SSG cu primerul acrilat (urmat de tăierea gelului și eluarea produsului), cea mai mare parte a ADN-ului izolat este monocatenar.

Am coroborat acest rezultat folosind o sondă de hibridizare modificată cu quencher (Figura 2B). Sonda a fost concepută pentru a aduce un quencher în apropierea fracțiunii de fluoresceină de pe produsul ssADN. La hibridizare, molecula quencher reduce intensitatea fluorescenței cu ∼90%. Deoarece sonda se hibridizează numai pe ssDNA, acest experiment demonstrează că produsul modificat cu fluoresceină era monocatenar. Ca un control negativ, am testat, de asemenea, produsul PCR dsDNA. Produsul PCR bicatenar nu a fost capabil să se hibridizeze cu sonda quencher; prin urmare, fluorescența sa a rămas practic neschimbată.

Aptameri sintetizați prin PCR purificați prin copolimerizare și electroforeză

Un ssADN extrem de pur este produs prin tehnica noastră SSG. Am purificat produșii de aptameri ssDNA din PCR folosind două metode: (i) SSG prin copolimerizare și electroforeză și (ii) o tehnică de imobilizare cu biotină-avidină descrisă în altă parte (de exemplu, fișa tehnică Polysciences 753) (17,18). Aptameri monocatenari au fost, de asemenea, generați prin sinteză chimică. Figura 3A prezintă aptameri ssDNA generați prin cele trei metode diferite. Banda 1 este un marker ladder pentru compararea dimensiunilor. Linia 2 arată ssADN purificat generat prin PCR cu un primer acrilat urmat de copolimerizare cu acrilamidă, electroforeză și purificare pe gel. Este vizibilă o singură bandă cu dimensiunea corectă pentru ssDNA. Linia 3 reprezintă ssADN-ul generat prin PCR cu un primer biotinilat urmat de purificare cu perle magnetice acoperite cu avidină. Banda 4 este ADN sintetizat chimic cu aceeași secvență. Aptamerul ssDNA purificat din SSG prin copolimerizare și electroforeză a arătat o puritate ridicată a ssDNA.

Am încercat apoi să testăm dacă această procedură a produs aptameri funcționali. Pentru a face acest lucru, am generat un aptamer descris anterior împotriva lizozimei folosind PCR cu primeri modificați. Aptamerul anti-lizozimă „Clona 1” a fost produs pentru prima dată în laboratorul Ellington și a fost selectat inițial ca aptamer de ARN (19); alte grupuri au raportat că secvența de ADN acționează, de asemenea, ca aptamer (20,21). Am constatat că atât PCR, cât și sinteza chimică a ADN-ului au produs un aptamer funcțional. Pe baza acestor experimente și a altor experimente, concluzionăm că acesta este unul dintre puținele cazuri excepționale în care ARN-ul și secvența sa parentală de ADN se leagă ambele de țintă. Acesta este un rezultat ciudat și întâmplător; majoritatea aptamerilor nu funcționează atunci când sunt traduși direct într-o altă chimie. Aceste rezultate coroborează numeroasele cazuri din literatura de specialitate care indică faptul că aptamerul anti-lizozimă Clona 1 este un caz special.

Analiza prin citometrie de flux a arătat, de asemenea, că aptamerul ssADN purificat de SSG este funcțional. Figura 4B prezintă microsferele acoperite cu lizozimă expuse la ADN aleatoriu, la aptamerul sintetizat chimic împotriva lizozimei sau la aptamerul nostru purificat de SSG împotriva lizozimei. Atât aptamerii purificați de SSG, cât și cei sintetizați chimic au prezentat o legătură puternică cu bilele acoperite cu lizozimă, în timp ce ADN-ul aleatoriu nu a prezentat o legătură semnificativă cu bilele de lizozimă. Acest lucru indică faptul că aceste interacțiuni sunt specifice pentru secvența de aptameri. Sferele neacoperite nu prezintă fluorescență cu sau fără aptamerul, ceea ce indică faptul că legarea este specifică proteinei.

Căldura eliberează ADN-ul din godeuri

Când se purifică aptameri de ADN ssDNA din produsul PCR prin metoda SSG, a fost necesar să se încălzească gelul pentru a facilita electroforeza ADN-ului (a se vedea „Materiale și metode”). Pentru a înțelege de ce a fost necesar acest lucru, am utilizat PAGE orizontal. Fără aplicarea căldurii, produsul PCR ssADN dorit a fost reținut în gode, în ciuda utilizării ureei 7 M și a gradientului de tensiune.

Prima noastră ipoteză a fost că această retenție s-a datorat celor 80 pb de hibridizare din produsul PCR. Pentru a testa această teorie, am redus complementaritatea la 23 pb prin aneantizarea ADN-ului aptamerului Clone 1 marcat cu fluoresceină (notat F-Aptamer în figura 4) cu un primer modificat cu acrilat de 23 de nucleotide (notat AC-Clone1-P2 în figura 4) și am efectuat SSG prin copolimerizare și electroforeză. În ciuda hibridizării relativ scurte de 23 pb, cantități semnificative de ADN aptameric au fost reținute în gode (figura 4A, banda de jos). Acest lucru a indicat că ipoteza noastră a fost incorectă, deoarece porțiunea de hibridizare mai scurtă de 23 pb, care ar trebui să fie ușor denaturată în uree 7 M, nu a permis eliberarea șirului de ADN ss dorit din puț.

Am testat în continuare ipoteza că retenția depinde de lungime. Aici, am aneantizat un oligonucleotid lung de 19 nucleotide modificat cu 5′-acridita (notat AC-ADN în figura 4) cu un oligonucleotid complet complementar de 19 nucleotide, marcat cu fluoresceină (notat F-ADN* în figura 4). În ciuda lungimii de hibridizare similare, ADN-ul scurt a fost purificat cu ușurință de complementul său într-un gel denaturant fără aplicarea de căldură. Practic, toată catena mobilă de 19 nucleotide, marcată cu fluoresceină, intră în gel (figura 4A, banda din mijloc). Pentru a demonstra că polimerul de 19 meri modificat cu acrilită a fost reținut, un șir modificat atât cu fluoresceină, cât și cu acrilită (notat AC-DNA-F în figura 4) a fost, de asemenea, copolimerizat în puț (banda de sus) și a fost reținut cu succes. (a se vedea „Materiale și metode” și tabelul suplimentar S1 pentru detalii privind secvența și nomenclatura)

După primele 20 de minute de electroforeză (fără încălzire), a fost clar că o mare parte din ADN-ul aptamer al clonei 1 nu era mobil (în ciuda unei lungimi de hibridizare scurte). Pentru a elibera ADN-ul aptameric din poliacrilamidă, a fost necesar să se încălzească gelul. Am încălzit tamponul de rulare până aproape de punctul de fierbere în cuptorul cu microunde și apoi l-am turnat peste gel în regiunea godeurilor. Electroforeza a fost apoi continuată timp de încă 20 de minute (figura 4B, banda de jos), iar banda de aptameri a devenit apoi mobilă. Această nouă bandă a avut aceeași mobilitate ca și banda mobilă inițială, ceea ce indică faptul că este vorba de aceeași specie de aptamer. De asemenea, acesta a fost același eșantion de ADN care a produs o singură bandă în figura 3A. Acest experiment demonstrează necesitatea de a încălzi gelul pentru a elibera tot ADN ss lung din poliacrilamidă. Reținerea ADN-ului în puț nu se datorează hibridizării, ci probabil încâlcirii în matricea de poliacrilamidă.

PAGE orizontal pentru generarea monocatenară și electroeluție integrată

Utilizarea unui gel orizontal permite efectuarea electroeluției, mai degrabă decât tăierea și extragerea benzii de produs. Utilizarea unui al doilea pieptene de extracție pentru godeuri suplimentare pentru electroeluție și extracție în PAGE orizontal a făcut ca SSG și electroeluția ADN-ului să fie mai rapide. Am utilizat software-ul Inkscape pentru a proiecta un pieptene separat pentru electroeluție, care era mai adânc și mai lat decât pieptenele de încărcare (a se vedea materialul suplimentar pentru șablonul utilizat pentru a tăia pieptenele). Desenul a fost decupat cu laser în acrilic cu un dispozitiv de tăiere cu laser CO2 (a se vedea figura 5, A și B).

În mod obișnuit, PAGE se realizează folosind un gel vertical între plăci de sticlă. Pentru a turna un gel PAGE orizontal, a fost necesar să se excludă oxigenul în timpul polimerizării. Am efectuat polimerizarea într-un sac umplut cu azot gazos (sau argon) pentru a exclude oxigenul. Gelul a fost turnat cu cei doi piepteni, iar electroforeza a fost efectuată conform procedurilor standard de electroforeză pe gel orizontal.

Figura 5C prezintă un gel orizontal pentru SSG prin copolimerizare și electroforeză cu electroeluzie. Culoarele 1-4 (de sus) conțin un grup de aptameri. Banda 5 a fost lăsată goală pentru a evita orice contaminare încrucișată involuntară; primerul standard din banda 6 a fost prezent pentru a distinge banda nedorită. Grupul a fost amplificat folosind un primer modificat cu acrilită și un primer marcat cu fluoresceină. Șirul modificat cu acrilită a fost reținut în gode. Produsul marcat cu fluoresceină este clar vizibil sub iluminarea cu LED albastru. Am lăsat amorsa să curgă prin godeurile de extracție și să iasă pe cealaltă parte a gelului (a se vedea figura 5D). Benzile de produs au putut fi apoi observate apropiindu-se de godeurile de extracție sub un transiluminator cu lumină albastră în timp real. Când benzile de produs au intrat în godeuri, acestea au fost aspirate cu o pipetă. Procesul a durat aproximativ 1 oră. Precipitarea și recuperarea au decurs apoi conform protocoalelor de selectare a aptamerilor publicate. Acest lucru a eliminat necesitatea unei etape separate de separare a catenei sau a unei extracții peste noapte a gelului.

Există mai multe metode de izolare a ADN ss din ADN ds. Metodele de purificare a ssADN din produsele PCR includ: deplasarea mobilității induse (22), imobilizarea cu bile de biotină-avidină (18), digestia selectivă cu o DNază (23) și adăugarea asimetrică de primeri PCR (24). Aceste metode variază în ceea ce privește costul, puritatea și scalabilitatea. O deplasare de mobilitate indusă (22) într-un primer poate cauza probleme în amplificare (de exemplu, primerii modificați cu PEG pot funcționa mai puțin bine în PCR), iar digestia enzimatică cu o DNază (23) sau ruperea chimică a unui șir va lăsa impurități (precum și introducerea unei alte etape în procesul global). Adăugarea asimetrică a amorselor PCR (24) va lăsa o cantitate semnificativă de dsADN în produs și este foarte predispusă la erori de amplificare. Cea mai populară metodă este extragerea șirului nedorit, biotinilat, cu ajutorul microsferelor acoperite cu avidină (18). Această metodă prezintă mai multe capcane. Primerul care nu a reacționat ocupă situsurile de avidină de pe microsfere, iar interacțiunea biotină-avidină se va rupe la temperatura de topire a ADN-ului dublu catenar lung (25). Acest lucru contribuie la apariția unor impurități semnificative de dsADN. Metodele bazate pe microsfere au costuri semnificative: 1,80 $/nMol pentru perlele de avidină plus 0,50 $/nMol pentru amorsă de biotină. SSG prin copolimerizare și electroforeză necesită doar amorsă de acrilită, care costă 0,80 $/nMol. Poliacrilamida este foarte ieftină și scalabilă. Mobilitatea electroforetică este o a doua dimensiune de purificare inerentă tehnicii. Atât șuvița modificată cu acrilită, cât și orice amorsă reziduală sunt eliminate din reacția PCR într-o singură etapă.

Am demonstrat că SSG poate fi utilizat pentru a purifica un aptamer funcțional. Tehnica ar putea fi utilizată, de asemenea, pentru a purifica un grup de ssADN în cursul selecției unui aptamer ADN. În plus, SSG ar putea găsi, de asemenea, aplicații pentru generarea de ssADN pentru sonde de afinitate sau coloane vertebrale pentru ADN origami (3). Este important de remarcat faptul că, în comparație cu sinteza chimică, producția de ADN prin PCR are o fidelitate mult mai mare a secvenței, ceea ce este crucial pentru aplicații precum calculul ADN/circuitele ADN (26).

.