Răspunsuri celulare și moleculare la tratamentul acut cu cocaină în celulele N2a de tip neuronal: mecanism potențial pentru rezistența sa la moartea celulară

Materiale

Cultură celulară

Celele N2a (CCL-131, ATCC) au fost menținute ca o cultură monostrat48 și au fost utilizate pe scară largă pentru studii privind substanțele de abuz14,49,50 sau afecțiuni ale SNC, cum ar fi boala Parkinson51 sau Alzheimer47,52,53. Un avantaj al acestei linii celulare este faptul că modificările morfologice fine datorate oricărei expuneri la substanțe chimice pot fi detectate cu ușurință datorită dimensiunii mai mari a celulelor. Cu excepția cazului în care se specifică altfel, toate experimentele din studiul nostru au fost efectuate în mediu RPMI-1640 fără roșu de fenol, care conține 10% FBS. Celulele postînsămânțate în plăci de cultură sau în farfurii au fost lăsate să crească 4-5 zile în incubator pentru diferențierea spontană a excrescențelor de neurite. Toate studiile au fost repetate de cel puțin două ori.

Morfologie

Pentru evaluările morfologice grosiere ale celulelor, celulele colorate cu cristal violet37 au fost fotomicrografiate cu ajutorul EVOS Cell Imaging Systems cu obiectiv ×40. În unele studii, morfologia sau vacuolele celulelor colorate cu cristal violet au fost luate cu ajutorul unui microscop Olympus IX-70 cu contrast de fază inversat. Extinderile de neurite au fost cuantificate cu ajutorul software-ului image J (National Institutes of Health).

Electrofiziologie

Whole-cell patch clamp a fost folosit pentru a înregistra de la celulele N2a cultivate pe plăcuțe de plastic. Plăcuțele de acoperire au fost spălate de trei ori cu soluție de înregistrare extracelulară care conține (în mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glucoză și 10 HEPES (312 mOsm, pH 7,4) și au fost incubate în această soluție la temperatura camerei. Plăcuțele de acoperire au fost fie lăsate netratate, fie tratate cu 6,25 μM sau 4 mM de cocaină direct în soluția extracelulară în timpul înregistrării. Electrozii de sticlă (rezistență 1-5 MΩ) au fost umpluți cu soluție intracelulară care conținea (în mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES și 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4). Celulele au fost vizualizate în contrast de fază cu un microscop inversat Nikon Eclipse Ti-U și camera digitală monocromă DS-Qi1 atașată.

Înregistrările au fost făcute cu un amplificator Axopatch 200B (Molecular Devices, CA) și digitizate cu un sistem Digidata 1440A (Molecular Devices, CA). Curenții ionici au fost înregistrați în cadrul unui protocol de fixare a tensiunii (de la -60 la 135 mV în trepte de 15 mV, cu o durată de 250 ms). Curenții postsinaptici spontani au fost înregistrați sub clemă de tensiune continuă la -80 mV timp de 2 min. Un protocol de fixare a curentului (de la -100 la 200 pA în pași de 20 pA, cu o durată de 800 ms) a fost utilizat pentru a evalua capacitatea celulelor N2a de a declanșa potențiale de acțiune ca răspuns la injecția de curent. Semnalele au fost filtrate la 1 kHz și eșantionate la 10 kHz. Datele au fost colectate și analizate cu ajutorul software-ului pCLAMP 10 (Molecular Devices, CA).

Tratamente

O cantitate cunoscută de clorhidrat de cocaină a fost dizolvată în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) ca stoc 1 M chiar înainte de teste. Pentru a simula concentrațiile farmacologice in vivo de cocaină, variind de la 1 nM la 6,25 μM, au fost pregătite în PBS mai multe stocuri de lucru (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200 și 400 μM); în mod similar, pentru concentrații mai mari de cocaină (2, 3 și 4 mM final), au fost pregătite în PBS stocuri de lucru de 80, 120 și 160 mM. Din fiecare stoc de lucru, s-au adăugat 5 μl de cocaină pe puț pentru a obține concentrațiile dorite, precum și pentru a preveni alterarea pH-ului în mediul de cultură37. Volumul final în fiecare gode a fost de 200 μl. În timp ce selectarea concentrațiilor mai mici s-a bazat pe rapoartele privind cocaina nano- până la micro-molară inferioară în celulele SNC ale dependenților13, concentrațiile mai mari s-au bazat pe mai multe studii in vitro14,15,16. Celulele cu mediu singur sau cu un volum egal de vehicul (PBS) în mediu au servit drept controale, în timp ce mediul lipsit de celule a fost luat drept martor. Pe baza studiilor noastre anterioare în celulele C6 astroglia-like6, în studiul de față, tratamentele cu cocaină au fost efectuate, de asemenea, timp de 1 h în scopul comparației. De altfel, efectul cocainei la dependenți dispare în această perioadă pentru cantități și căi de administrare tipice33. Într-un subgrup de experimente, celulele din plăcile cu 96 de godeuri au fost pretratate cu 1 µM YM155, un inhibitor al genei survivin, timp de 30 min, urmat de co-tratamentul cu cocaină (2-4 mM) timp de 1 h și au fost evaluate pentru viabilitatea celulară, în timp ce în alte studii, celulele au fost pretratate cu 5 μM PIK-75, un inhibitor al Nrf-224, timp de 30 min înainte de co-tratamentul cu cocaină (2-4 mM) timp de 1 h și au fost evaluate pentru viabilitatea celulară și nivelurile de GSH.

Viabilitatea și vacuolarea

Viabilitatea celulară a fost evaluată prin absorbția colorantului cristal violet, așa cum a fost descris anterior54,55. Gradul de vacuolare a celulelor a fost cuantificat în celulele fixate cu glutaraldehidă prin absorbția colorantului roșu neutru, așa cum a fost descris anterior56. Colorantul a fost extras cu etanol 70% și acid clorhidric 0,37%, iar absorbția la 540 nm a fost măsurată cu un cititor de plăci. Celulele colorate cu cristal violet au fost folosite pentru fotomicrografia vacuolelor cu ajutorul unui microscop Olympus IX-70 cu contrast de fază inversat și obiectiv ×40.

Video-microscopie

Pentru videografia în direct, una dintre lentilele oculare ale microscopului Olympus IX-70 cu contrast de fază inversat a fost înlocuită cu un sistem standard de cameră video oculară. Ieșirea conectorului video a fost atașată la un computer pentru vizualizarea imaginilor pe monitor cu ajutorul programului software Electronic Ocular -R-AMCap, furnizat de Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, China). Documentarea video a fost realizată la o viteză de 14 cadre pe secundă.

Sesizarea integrității membranei celulare

Integritatea membranei celulare a fost determinată prin măsurarea eliberării de LDH citoplasmatic cu kitul de testare non-radioactiv CytoTox 96 (Promega, Madison, WI), conform instrucțiunilor furnizate de producător. Pe scurt, celulele din plăci de microtitrare cu 96 de godeuri au fost tratate cu diferite concentrații de cocaină (2, 3 și 4 mM) timp de 1 h. Apoi, 50 μl de mediu de testare au fost transferate într-o nouă placă cu 96 de godeuri, amestecate cu un volum egal de amestec de substrat din kit și incubate timp de 30 de minute la 37 °C. Absorbanța a fost măsurată într-un cititor de plăci la 490 nm.

Măsurarea ROS intracelulare

Celulele din plăci cu 96 de godeuri au fost tratate cu cocaină la 2, 3 și 4 mM timp de 1 h, urmată de colorarea cu un colorant permeabil la celule H2DCFDA (10 μM final) timp de 30 min6. După spălarea delicată și uscarea la aer a celulelor, s-a adăugat PBS (100 μl/poci). Plăcile au fost citite cu filtrul de excitație setat la 485 nm și filtrul de emisie la 530 nm într-un cititor automat (BioTek™ Synergy HTX multimode micro plate reader, BioTek Instruments, Winooski, VT).

Analiză de peroxidare a lipidelor

Celele au fost însămânțate la o densitate inițială de 0,3 × 106 celule pe puț în plăci cu șase puțuri. Peroxidarea lipidelor a fost măsurată conform descrierii anterioare57. Pe scurt, după tratamentul cu cocaină la 2, 3 și 4 mM timp de 1 h, celulele au fost recoltate și centrifugate la 13.000 rpm pe o microcentrifugă de masă timp de 6 min. Toate peletele de celule au fost sonicate în PBS la gheață timp de 3 s și au fost transferate în tuburi de sticlă. Apoi, lizatele au fost amestecate cu 30% acid tricloroacetic, 0,37% acid tiobarbituric (TBA). Amestecul a fost fiert timp de 10 min, răcit la temperatura camerei (RT), transferat în noi tuburi falcon și centrifugat la 3038 × g timp de 10 min. Supernatantul limpede a fost transferat într-o placă cu 96 de godeuri și absorbția la 535 nm a fost măsurată într-un cititor de microplăci. Mediul limpede fără celule a fost folosit ca martor.

Activitatea metabolică mitocondrială generală și potențialul de membrană

Celulele (2 × 104) au fost tratate cu diferite concentrații de cocaină (2, 3 și 4 mM) timp de 1 h în plăci de microtitrare cu 96 de puțuri. Apoi, plăcile au fost centrifugate la 304 × g timp de 4 min, iar mediul care conținea cocaină a fost aruncat cu grijă. După adăugarea imediată de mediu proaspăt în celule (200 μl), s-au adăugat imediat 10 μl de MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5(3-carboximetilfenol)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazoliu, Promega) pe puț, așa cum s-a raportat anterior58 și s-a incubat timp de 30 min la 37 °C. Absorbția a fost măsurată într-un cititor de microplăci la 490 nm. Potențialul membranar a fost testat conform procedurii anterioare46. La sfârșitul tratamentului de 1 h cu cocaină, celulele monostrat au fost acoperite cu 100 μl de glutaraldehidă apoasă 0,25 % pentru fixare, conținând Rh 123 pentru a obține o concentrație finală de 2,6 μM timp de 30 min la temperatura de repaus. Supernatantul a fost aruncat, iar plăcile au fost spălate cu apă și uscate la aer în hotă. În cele din urmă, s-au adăugat 100 μl de Triton×100 0,1% în PBS pentru fiecare puț și s-au incubat la 37 °C timp de 1 h. Plăcile au fost citite cu filtrul de excitație setat la 485 nm și filtrul de emisie la 538 nm pe un cititor de microplăci multimodal BioTek™ Synergy™ HTX.

Detecția lactatului

Studiile efectuate pe celule cultivate în mediu conținând 10% FBS au dat valori de fond ridicate din cauza interacțiunii serului cu unele dintre componentele kitului (Trinity Biotech, Jamestown, NY). Astfel, în studiile noastre ulterioare, înainte de tratamente, mediul care conținea 10% FBS a fost înlocuit cu ser redus (0,1% FBS) în plăci de microtitrare cu 96 de puțuri (2 × 104 celule pe puț). Reactivul kitului a fost dizolvat în soluție cromogenică care a constat din 5,3 mM de acid vanilic, 2,9 mM de 4-amino antipirină și aproximativ 4 unități de peroxidază de hrean. La sfârșitul tratamentului cu cocaină de 1 h, reactivul kitului a fost adăugat direct în godeuri (20 μl pentru 200 μl), iar plăcile au fost ținute în incubator la 37 °C pentru dezvoltarea culorii (5-10 min). Absorbanța de la celulele netratate a fost luată ca martor, în timp ce mediul lipsit de celule a fost luat ca martor. Absorbanța a fost măsurată la 490 nm într-un cititor de microplăci.

Spectroscopie RMN

Liberarea de lactat din celule a fost detectată prin spectroscopie RMN de protoni (1H+). Deoarece cantitatea de ser nu interferează în această metodă, am utilizat 10% FBS în mediu în plăci de microtitrare cu 96 de godeuri (2 × 104 celule/200 μl pe gode). La sfârșitul tratamentului cu cocaină de 1 h, mediul (0,15 ml pe gode) de la toate replicile (n = 12) din fiecare tratament a fost grupat (1,8 ml) în tuburile etichetate. Mediul de la celulele netratate a fost utilizat ca martor. Deoarece probele tratate conțineau 2-4 mM de cocaină, am adăugat cocaină (4 mM final) în mediul gol. Analizele RMN au fost efectuate pe Bruker Avance 800 (\(\nu _0\) = 800,23 MHz) care este echipat cu o criosonda TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z (intensitatea maximă a gradientului de câmp z este de 48 G/cm). Pentru obținerea unui spectru RMN unidimensional (1D), au fost achiziționate 16 tranziții și coadunate cu o întârziere de achiziție de 3 s. Punctele de date (32 000) au fost utilizate pentru a obține o lățime spectrală de 7500 Hz. Picul dominant al apei poziționat la 4,75 ppm în spectru a fost eliminat prin utilizarea secvenței de impulsuri WATERGATE W520. O lățime de bandă de 3000 Hz de-a lungul fiecărei părți a vârfului de apă a fost dată ca fereastră spectrală pentru observarea vârfurilor de solut prin utilizarea unui timp de întârziere de 333,3 μs pentru secvențele de impulsuri WATERGATE. Pentru cuantificarea lactatului din soluția de probă s-a preparat un etalon extern, o soluție apoasă de DMSO de 3,3 mM.

Măsurarea H2S în mediul de cultură celulară

Celele au fost însămânțate la o densitate inițială de 2 × 104 pe puț în plăci cu 96 de puțuri. Înainte de tratamentul cu cocaină, 1,64% acetat de zinc apos de 1,64%59,60 (final: 0,041%) a fost adăugat la celule pentru a transforma gazul volatil H2S în sulfură de zinc în timpul tratamentului cu cocaină. După 1 oră de tratament cu 2, 3 și 4 mM de cocaină, 17,453 mM de sulfat de N,N-dimetil-p-fenilendiamină în HCl 7,2 M (final: 2,55 mM) și 26,18 mM de FeCl3 în HCl 1,2 M (final: 3,83 mM) au fost adăugate în godeuri și vortexate ușor. Bulele din mediu au fost îndepărtate prin adăugarea a 5 μl de etanol rece în toate godeurile, chiar înainte de citirea plăcilor la 670 nm într-un cititor de microplăci.

Testarea bioluminescenței ATP

Celulele din plăci de microtitrare cu 96 de godeuri au fost tratate cu diferite concentrații de cocaină (2, 3 și 4 mM) timp de 1 h. ATP total a fost măsurat cu ajutorul kitului de analiză bioluminescentă a ATP pentru celule somatice (FLASC, Sigma-Aldrich), în conformitate cu instrucțiunile kitului furnizate de producător. Pe scurt, la sfârșitul tratamentului, s-au adăugat 75 μl de soluție de eliberare a ATP din celule somatice pentru fiecare gode pentru a liza celulele. Apoi, 50 μl de lizat a fost transferat în noi plăci de 96 de godeuri albe, cu fundul transparent, care conțineau deja 50 μl de enzimă ATP assay mix sub lumină redusă. Luminescența a fost măsurată imediat pe un cititor de microplăci multimodal BioTek™ Synergy™ HTX.

Isolarea ARN și sinteza ADNc

Celele au fost însămânțate la o densitate de 2 × 106 în vase de cultură cu diametrul de 100 mm. În momentul tratamentului, celulele au ajuns la o confluență de aproximativ 65-70%. După 1 h de tratament cu 2-4 mM de cocaină, celulele au fost recoltate prin răzuire și centrifugate la 1125 × g timp de 5 min. ARN-ul total a fost izolat în conformitate cu protocolul furnizat de producător (Qiagen Sciences, German town, MD) cu ajutorul coloanelor de centrifugare RNeasy mini. Pe coloană s-a efectuat un tratament cu DNază I (Qiagen Sciences). ARN total din coloană a fost eluat cu 20 μl de apă fără RNază. În vederea cuantificării, ARN-ul de pe gheață a fost diluat în apă fără RNază în proporție de 1:10. Cantitatea de ARN total a fost măsurată cu ajutorul spectrofotometrului Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). ARN-ul a prezentat un raport de >1,95 la 260/280 nm și a fost utilizat ulterior pentru sinteza ADNc. Un microgram de ARN total a fost utilizat pentru a produce ADNc folosind un kit de sinteză ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA) în conformitate cu instrucțiunile producătorului.

Expresia relativă prin RT-PCR cantitativă

Analiza expresiei genice a Nrf-2, survivin (Birc5) și GAPDH prin qPCR a fost efectuată într-un termociclator iCycler cu sistemul de detecție MyiQ (Bio-Rad) folosind supermixul iQ SYBR Green. Produsele Nrf-2, survivin și GAPDH au fost sintetizate prin reacții PCR separate, efectuate în volum final de 20 μl cu 2 μl de probă de ADNc și 500 nM de primeri specifici. Condițiile de ciclizare au fost următoarele: 95 °C timp de 10 min, urmat de 40 de cicluri de 95 °C timp de 15 s, 55 °C timp de 30 s și 72 °C timp de 30 s, în timp ce analiza curbei de topire după PCR a fost efectuată la 55-95 °C. Cuantificarea relativă a expresiilor genice a fost realizată în conformitate cu metoda 2-△△CT61 cu GAPDH ca și control endogen. Secvențele de amorsă utilizate pentru analize sunt prezentate în tabelul 1.

Total GSH assay

După ce au fost tratate cu diferite concentrații de cocaină (2-4 mM) în mediu complet timp de 1 h în plăci de microtitrare cu 96 de godeuri, celulele au fost fixate cu glutaraldehidă 0,25% timp de 30 min, urmate de o spălare delicată de trei ori, și uscate la aer. GSH celular total a fost testat așa cum s-a descris anterior62. Absorbția a fost măsurată la 412 nm într-un cititor de microplăci.

Prepararea lisatelor de celule întregi

Pentru testele enzimatice, celulele au fost însămânțate la o densitate de 2 × 106 în vase de cultură cu diametrul de 100 mm. După 1 h de tratament cu 2-4 mM de cocaină, celulele au fost recoltate cu ajutorul racletelor celulare. După centrifugare la 1620 × g timp de 5 minute, peleții de celule au fost depozitați la -70 °C până la utilizare ulterioară. În ziua testelor, granulele au fost resuspendate în 0,5 ml PBS și au fost sonicate de două ori la gheață timp de 15 s. Conținutul a fost transferat în tuburi eppendorf și microcentrifugat la 5000 rpm timp de 5 min. Supernatanții au fost transferați în tuburi noi și utilizați pentru testele enzimatice. Concentrația de proteine din fiecare lizat a fost determinată cu ajutorul kitului de analiză a proteinelor BCA (Pierce, Rockford, IL), conform instrucțiunilor producătorului, luând seroalbumina bovină ca referință standard.

Analiză de catalaza

A fost analizată conform metodei anterioare63. Amestecul de reacție (450 μl) într-o cuvă de cuarț conținea 50 μl de lizat celular (60 μg), 250 μl de tampon fosfat 50 mM (pH 7,0). Reacția a fost inițiată prin adăugarea a 150 μl de H2O2 30 mM (10 mM final). Scăderea absorbanței la 240 nm a fost monitorizată timp de 2 minute într-un spectrofotometru Genesys 10 S UV-Vis (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). Activitatea enzimatică a fost calculată folosind coeficientul de extincție de 0,00706 pe mmol pe mm, iar unitatea de activitate enzimatică a fost exprimată ca mmol de H2O2 descompus pe minut pe mg de proteină. Apoi, activitatea enzimatică a probelor tratate a fost comparată cu cea a martorului (100%).

TestareaGPx

A fost testată conform procedurii publicate64. Amestecul de reacție (500 μl) a conținut 1 mM GSH, 0,15 mM NADPH, 0,12 unități de glutation reductază (GR), 0,1 mM azidă de sodiu în fosfat de potasiu 0,1 M (pH 7,0 cu 1 mM EDTA). Azida de sodiu a fost adăugată în amestecul de reacție pentru a inhiba activitatea catalazei endogene. Amestecul de reacție a fost incubat cu 60 μg de probă timp de 10 min fără NADPH, iar reacția a fost inițiată prin adăugarea de NADPH și H2O2 la o concentrație finală de 150 μM. Viteza de consum a NADPH a fost monitorizată la 340 nm timp de 3 min. O unitate de activitate GPx a fost definită ca fiind cantitatea de enzimă necesară pentru a consuma 1 μmol de NADPH/min în testul cuplat, iar activitatea a fost exprimată pe mg de proteină. Apoi, activitatea enzimatică a probelor tratate a fost comparată cu cea a martorului (100%).

Analiză statistică

Rezultatele experimentale (n = numărul de godeuri grupate din cel puțin două experimente diferite) au fost prezentate ca medie ± SEM. Toate graficele cu bare au fost trasate cu ajutorul unui software GraphPad Prism, versiunea 3.00 (San Diego, CA). Datele au fost analizate pentru semnificație prin ANOVA cu o singură cale și apoi au fost comparate cu ajutorul testelor de comparație multiplă Dunnett sau Bonferroni. Valorile testului de P < 0,05 și P < 0,01 au fost considerate semnificative și, respectiv, foarte semnificative.