Enzime și componente cheieEdit
Procesul de recombinare V(D)J este mediat de recombinaza VDJ, care este o colecție diversă de enzime. Enzimele cheie implicate sunt genele de activare a recombinării 1 și 2 (RAG), deoxinucleotidil transferaza terminală (TdT) și nucleaza Artemis, un membru al căii omniprezente de îmbinare a capetelor non-homologe (NHEJ) pentru repararea ADN-ului. Se știe că mai multe alte enzime sunt implicate în acest proces, printre care se numără proteina kinaza dependentă de ADN (DNA-PK), proteina de reparare încrucișată cu raze X 4 (XRCC4), ADN ligază IV, factorul de îmbinare neomologă a capetelor 1 (NHEJ1; cunoscut și sub numele de Cernunnos sau XRCC4-like factor ), recent descoperitul paralog al XRCC4 și XLF (PAXX) și ADN polimerazele λ și μ. Unele enzime implicate sunt specifice limfocitelor (de exemplu, RAG, TdT), în timp ce altele se găsesc în alte tipuri de celule și chiar omniprezente (de exemplu, componentele NHEJ).
Pentru a menține specificitatea recombinării, recombinaza V(D)J recunoaște și se leagă de secvențele de semnalizare a recombinării (RSS) care flanchează segmentele variabile (V), de diversitate (D) și de îmbinare (J) ale genelor. RSS sunt compuse din trei elemente: un heptamer de șapte nucleotide conservate, o regiune spațioasă cu o lungime de 12 sau 23 de pași de bază și un nonamer de nouă nucleotide conservate. În timp ce majoritatea RSS-urilor variază în ceea ce privește secvența, secvențele consensuale ale heptamerului și ale nonameralului sunt CACAGTG și, respectiv, ACAAAAACC; și, deși secvența regiunii de spațiere este slab conservată, lungimea acesteia este foarte bine conservată. Lungimea regiunii de spațiere corespunde cu aproximativ una (12 pași de bază) sau două spire (23 de pași de bază) ale helixului de ADN. În conformitate cu ceea ce este cunoscut sub numele de regula 12/23, segmentele de gene care urmează să fie recombinate sunt, de obicei, adiacente la RSS cu lungimi diferite ale spațiatorului (de exemplu, unul are un „12RSS” și altul are un „23RSS”). Aceasta este o caracteristică importantă în reglarea recombinării V(D)J.
ProcessEdit
Recombinarea V(D)J începe atunci când recombinaza V(D)J (prin activitatea lui RAG1) se leagă de un RSS care flanchează un segment de genă codificatoare (V, D sau J) și creează o crestătură monocatenară în ADN între prima bază a RSS (chiar înainte de heptamer) și segmentul codificator. Acest lucru este în esență neutru din punct de vedere energetic (nu este nevoie de hidroliza ATP) și are ca rezultat formarea unei grupări hidroxil libere 3′ și a unei grupări fosfat 5′ pe aceeași catenă. Gruparea hidroxil reactivă este poziționată de recombinaza pentru a ataca legătura fosfodiester a catenei opuse, formând două capete de ADN: un ac de păr (buclă de tulpină) pe segmentul de codificare și un capăt bont pe segmentul de semnal. Modelul actual este că nicking-ul ADN-ului și formarea hairpin-ului are loc pe ambele șiruri simultan (sau aproape simultan) într-un complex cunoscut sub numele de centru de recombinare.
Extremitățile de semnal blunt sunt ligaturate la culoare împreună pentru a forma o bucată circulară de ADN care conține toate secvențele care intervin între segmentele de codificare, cunoscută sub numele de articulație de semnal (deși de natură circulară, aceasta nu trebuie confundată cu o plasmidă). Deși inițial se credea că se pierd în timpul diviziunilor celulare succesive, există dovezi că joncțiunile de semnal pot reintra în genom și pot duce la patologii prin activarea oncogenelor sau întreruperea funcției (funcțiilor) genelor supresoare de tumori.
Extremitățile codificatoare sunt procesate în continuare înainte de ligatura lor prin mai multe evenimente care, în cele din urmă, duc la diversitatea joncțiunilor. Prelucrarea începe atunci când DNA-PK se leagă de fiecare capăt de ADN rupt și recrutează mai multe alte proteine, inclusiv Artemis, XRCC4, ADN ligază IV, Cernunnos și mai multe ADN polimeraze. DNA-PK formează un complex care duce la autofosforilarea sa, ceea ce duce la activarea Artemis. Pinii de păr de la capătul de codificare se deschid prin activitatea lui Artemis. Dacă acestea sunt deschise în centru, va rezulta un capăt de ADN bont; cu toate acestea, în multe cazuri, deschiderea este „descentrată” și are ca rezultat baze suplimentare rămase pe o catenă (un overhang). Acestea sunt cunoscute sub numele de nucleotide palindromice (P) datorită naturii palindromice a secvenței produse atunci când enzimele de reparare a ADN-ului rezolvă suprapunerea. Procesul de deschidere a acului de păr de către Artemis este o etapă crucială a recombinării V(D)J și este defectuoasă în modelul de șoarece cu imunodeficiență combinată severă (scid).
În continuare, XRCC4, Cernunnos și DNA-PK aliniază capetele ADN-ului și recrutează deoxinucleotidil transferaza terminală (TdT), o ADN-polimerază independentă de șablon care adaugă nucleotide neșablonate (N) la capătul codificator. Adăugarea este în mare parte aleatorie, dar TdT manifestă o preferință pentru nucleotidele G/C. La fel ca în cazul tuturor ADN polimerazelor cunoscute, TdT adaugă nucleotide la un catenar în direcția 5′ spre 3′.
În sfârșit, exonucleazele pot elimina bazele de la capetele de codificare (inclusiv orice nucleotide P sau N care s-ar fi putut forma). ADN polimerazele λ și μ inserează apoi nucleotide suplimentare, după cum este necesar, pentru a face cele două capete compatibile pentru unire. Acesta este un proces stocastic, prin urmare, poate avea loc orice combinație între adăugarea de nucleotide P și N și eliminarea exonucleolitică (sau deloc). În cele din urmă, capetele codificatoare procesate sunt ligaturate împreună de către ADN ligazele IV.
Toate aceste evenimente de procesare au ca rezultat un paratop care este foarte variabil, chiar și atunci când aceleași segmente genetice sunt recombinate. Recombinarea V(D)J permite generarea de imunoglobuline și de receptori ai celulelor T pentru antigene pe care nici organismul, nici strămoșii săi nu trebuie să le fi întâlnit anterior, permițând un răspuns imunitar adaptativ la agenții patogeni noi care se dezvoltă sau la cei care se schimbă frecvent (de exemplu, gripa sezonieră). Cu toate acestea, un avertisment major al acestui proces este că secvența de ADN trebuie să rămână în cadru pentru a menține secvența corectă de aminoacizi în produsul proteic final. Dacă secvența rezultată este în afara cadrului, dezvoltarea celulei va fi oprită, iar aceasta nu va supraviețui până la maturitate. Prin urmare, recombinarea V(D)J este un proces foarte costisitor care trebuie să fie (și este) strict reglementat și controlat.
.